동물 세럼 - 무료 인간 줄기 세포 배양을위한 효율적인 보충으로 풀링 인간 혈소판 Lysate (pHPL)의 준비

본 프로토콜은 혈소판 풍부 혈장으로부터 다량의 인간 혈소판 용해물을 준비하는 과정을 제시합니다. 동결-해동 사이클을 1회 수행하여 혈소판을 용해시킵니다. 그 후, 최소 10단위의 인간 혈소판 용해물을 하나의 배치로 모아 혼합 인간 혈소판 용해물(PHPL)을 제조합니다.

약 3L의 이 용액을 다시 여러 개의 분주액(aliquots)으로 나누어 냉동함으로써 혈소판 파편을 제거합니다. 이 분주액들을 해동하여 바이알에 옮긴 후 원심 분리합니다. 상층액은 혈소판 파편이 제거된 PHPL이며, 여기에는 세포 배양 보충제 등으로 사용되는 혈소판 유래 성장 인자들이 포함되어 있습니다.

남은 혈소판 파편 펠렛은 폐기합니다. 안녕하세요, Grads 의과대학 줄기세포 연구 부문 Dr.TRO 연구실의 Kadina Sharmo입니다. 오늘은 인간 혈소판 분리물 풀(pool)을 준비하는 절차를 보여드리겠습니다.

우리는 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma)에서 시작하여 수차례의 동결-융해 주기를 거친 후, 혈소판 파편을 제거할 것입니다. 저희 실험실에서는 태아 송아지 혈청(fatal boen serum)의 대안으로 세포 배양에 충분한 보충제를 얻기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

본 프로토콜은 PRP라고 불리는 혈소판 풍부 혈장으로 시작합니다. 이 혈장은 성분채집술(Cy Apheresis)을 통해 준비되었거나 버피 코트(Buffy coats)에서 유도되었을 수 있습니다. 수혈 의학 분야 외의 연구자는 지역 혈액원이나 기타 공인 제공업체로부터 PRP를 구매해야 합니다.

각 PRP 유닛에서 20 milliliters를 연결된 작은 백으로 옮긴 후, 웰더(welder)를 사용하여 백을 분리함으로써 PRP 유닛의 무균 상태를 확인하십시오. 이 분취액은 조제 직후 무균 시험을 위해 미생물 실험실로 보낼 수 있습니다. PRP 유닛을 원래의 보관 백에 담아 최소 -20 °C에서 냉동시키는 것이 중요합니다.

세균 테스트 결과가 음성으로 나오면 다음 단계를 수행할 수 있습니다. 이제 HPL이라 칭하는 인간 혈소판 용해물이 과도하게 가열되지 않도록 주의하면서, 얼음 결정이 사라질 때까지 HPL 유닛을 37 °C 항온 수조에 넣습니다. 각 혈소판 용해물 풀에 대해 표준화된 제품을 준비하기 위해, 이 동결-해동 단계 이후에 혈소판을 용해시켜야 합니다.

해동된 PRP 10~15 단위를 수집합니다. 각 HPL 백을 순차적으로 풀링 더블 백에 연결한 다음, HPL을 이 두 백으로 옮깁니다. 웰더를 사용하여 빈 HPL 백을 분리합니다.

두 백의 내용물을 혼합하여 최종 부피 3~4 L의 pooled human platelet lysate를 준비합니다. 이를 PHPL이라고 합니다. 작은 백을 연결하고 PHPL 샘플 20 mL를 채취하여 혼합 제품의 무균 상태를 확인합니다.

풀링 더블 백에 소형 백들을 연결하여 추가 처리를 위한 PHPL 샘플을 분주합니다. 소형 보관 백에 약 250 milliliters의 부피를 옮긴 후, 웰더를 사용하여 채워진 백들을 분리합니다. 이제 혈소판 파쇄율과 방출되는 성장 인자의 양을 증가시키기 위해 추가적인 동결-해동 사이클을 수행합니다.

분주된 PHBL이 담긴 작은 백들을 -20 °C에서 냉동하여 이를 수행하십시오. 그 후, 층류 후드 내에서 37 °C 항온수조를 사용하여 백들을 해동하십시오.

멸균 가위를 사용하여 각 백의 튜브를 자르고 개봉한 다음, PHPL을 50 milliliter 바이알에 붓습니다. 종종 혈소판 조각이 혈소판을 응집시키거나 동종면역을 유발할 수 있습니다. 이러한 상태를 방지하려면, 냉장 원심분리기를 사용하여 4,000 GS에서 15분 동안 원심분리하여 PHPL에서 조각들을 제거하십시오.

다음으로, 세포 배양액에 파편이 섞이는 것을 방지하기 위해 혈소판 펠릿은 폐기하고 혈장 상층액을 최종 보관용 바이알에 분주합니다. PHPL을 50 milliliter씩 분주하여 추후 사용 시까지 minus 20 degrees에서 다시 냉동 보관합니다. 혈소판 파편이 제거된 PHPL이 생성되었으므로, 이제 용해물 특성을 분석할 수 있습니다.

혼합 혈소판 용해물의 기능과 품질은 세포 배양을 통해 테스트하며, 세포 증식의 효율적인 자극, 중간엽 기질 세포(MSC) 및 내피 콜로니 형성 세포(E CFCs)의 증식이 혈소판 파편이 제거된 PHPL을 사용하여 성공적으로 이루어짐으로써 입증됩니다. 배지 레시피에 대한 자세한 내용은 여기의 서면 프로토콜을 참조하십시오. 혼합 인간 혈소판 용해물의 두 가지 응용 분야.

중간엽 기질 세포 배양에서 공여라 한 명의 MSC를 PHPL 또는 혈소판 파편이 제거된 PHPL로 배양한 결과가 나타나 있습니다. 표시된 바와 같이, 파편 제거 PHPL만 사용했을 때와 비교하여 여기서는 더 많은 파편 오염이 확인됩니다. 혈소판 파편은 MSC의 성장을 충분히 지원하지 못합니다.

세 이미지 모두 배양 13일 후에 촬영되었습니다. 공여자 2의 MSC는 혈소판 풍부 혈장 대신 혈소판 파편이 제거된 PHPL에서 9일 동안 배양되었습니다. 혈소판 용해를 거치지 않은 PRP는 MSC의 성장을 충분히 지원하지 못한다는 점에 유의하십시오.

인간 제대혈 유래 MSC를 분리하고 배양하기 위해 파편이 제거된 PHPL을 사용하는 방법을 설명하는 Andreas Reish의 JoVE 프로토콜을 함께 참조하시기 바랍니다. 지금까지 줄기세포 배양에서 동물성 혈청을 완전히 대체할 수 있는 PHPL 제조 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 배양 배지에 헤파린과 PHPL을 첨가하기 전에 혈소판 파편을 제거하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.