형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

이 기술에서는 유리 커버슬립을 불활성 PEG 분자와 비오틴 PEG 분자의 혼합물로 기능화합니다. 이렇게 기능화된 표면으로 플로우 셀을 제작하여 TIRF 현미경 위에 배치합니다. 그 후 다가 스트렙타비딘을 이용하여 비오틴화된 롤링 서클 템플릿을 표면에 부착합니다.

repli zone 단백질과 뉴클레오타이드의 첨가로 기질이 복제되면, 생성된 이중 가닥 DNA는 층류(laminar flow)를 통해 연장되며 인터콜레이팅 염료를 사용하여 실시간으로 이미징됩니다. 안녕하세요, 저는 하버드 의과대학 생물화학 및 분자약리학과의 Antoine Van Ian 연구실 소속 Nathan Tanner입니다. 저는 같은 Van Noian 연구실의 Joe Laro입니다.

오늘은 단일 분자 수준에서 DNA 복제를 실시간으로 관찰하는 형광 이미징 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 개별 복제 복합체의 조정된 DNA 합성 활성을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하려면 TBS 버퍼에서 10배 과량의 올리고를 첨가하고 65 °C로 가열한 후, 히트 블록의 전원을 꺼서 천천히 냉각시켜 프라이머를 적절히 어닐링함으로써 biotinylated tail oligo를 M 13 단일 가닥 DNA에 어닐링합니다. 프라이머 M 13이 준비되면, 이를 dNDPs와 magnesium chloride가 포함된 64 nM T7 DNA polymerase 및 T7 복제 버퍼 혼합물에 첨가하고 37 °C에서 12분 동안 반응을 인큐베이션합니다. 인큐베이션이 끝나면 100 mM EDTA로 반응을 정지시킵니다.

다음으로, 페놀-이소아밀 알코올-클로로포름 추출법을 사용하여 충전된 생성물 DNA를 정제하고 TE 버퍼 또는 기타 적절한 보관 버퍼로 투석합니다. 잔류 프라이머를 회수하기 위해 각 유기상을 다시 추출합니다. M 13 투석 후 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 결정합니다. 템플릿 준비 과정을 한 번 수행하면 수백에서 수천 건의 단일 분자 실험에 충분한 나노몰 농도의 템플릿을 제작할 수 있습니다.

DNA 준비가 완료되었으므로, 이제 기능화된 커버슬립 준비 단계로 진행하십시오. 복제될 DNA는 Amil Lane으로 기능화된 유리 커버슬립에 부착됩니다. Amil의 Oxy 그룹이 유리에 결합하여, 비오틴화된 peg 분자와 결합할 수 있는 아민이 남게 됩니다. 이 코팅은 표면으로의 비특이적 결합을 줄이는 데 도움이 됩니다.

유리 커버슬립을 철저히 세척하려면, 커버슬립을 염색병에 넣고 에탄올을 채운 뒤 30분 동안 초음파 세척합니다. 염색병을 헹군 후 1 M 수산화칼륨 용액을 채우고 30분 동안 초음파 세척하며, 두 세척 과정을 모두 반복합니다. 첫 번째 기능화 반응을 위해 모든 수분 흔적을 제거해야 합니다.

염색 병에 아세톤을 채우고 10분 동안 초음파 처리합니다. 병을 비운 후 다시 아세톤으로 채웁니다. 이어서 병에 sine 시약을 첨가하고 2분 동안 교반합니다.

그 다음 과량의 물로 퀀칭합니다. 그런 다음 커버슬립을 오븐에서 110 °C로 30분 동안 가열하여 건조시킵니다. 다음으로, 가열된 PEG를 사용하여 약 0.2% w/v 농도의 PEG 혼합물을 준비합니다. 유리 커버슬립 스페이서를 포함하면 커버슬립을 분리할 수 있으며, 건조된 실란화 커버슬립 위에 100 µL를 피펫으로 분주합니다.

그 위에 두 번째 커버 슬립을 덮습니다. 커버 슬립을 PEG 용액에 넣고 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각각의 커버 슬립 쌍을 분리하고 물로 충분히 세척합니다.

커버슬립의 한쪽 면에만 peg가 코팅되므로, 기능화된 면이 위를 향하도록 주의하십시오. 마지막으로, 압축 공기로 커버슬립을 건조시킨 후 데시케이터 내 진공 상태로 보관하며, 표면은 최소 한 달 동안 안정적으로 유지됩니다. 따라서 수십 개의 커버슬립을 한 번에 제작하여 필요할 때마다 사용할 수 있습니다.

커버슬립이 준비되었으므로, 단일 분자 실험을 위한 유동 챔버를 조립할 수 있습니다. 우선, 이후 단계에서 기포를 제거하기 위해 BSA가 포함된 블로킹 버퍼 20 내지 25 milliliters를 데시케이터에 넣습니다. 다음으로, streptavidin 25 microliters를 PBS 100 microliters에 희석하여 peg로 기능화된 커버슬립 표면에 도포합니다. 챔버의 다른 부품들을 준비하는 동안 streptavidin이 표면의 biotin에 결합할 수 있도록 상온에서 20분 동안 인큐베이션합니다.

커버 슬립을 인큐베이팅하는 동안, 유체 챔버 조립에 사용된 쿼츠 슬라이드의 크기에 맞게 양면에 보호지가 붙어 있는 양면테이프를 자릅니다. 테이프 위에 연필로 튜브 구멍의 위치를 표시하여 유체 챔버의 외곽선이 테이프에 그려지도록 합니다. 구멍 표시를 마친 후, 표시된 부분을 중심으로 너비 2 mm의 직사각형을 만듭니다.

이 직사각형은 유로(flow channel) 역할을 하므로, 측면을 직선으로 만들고 튜브의 입구와 출구 주변에 충분한 공간을 남겨두십시오. 이제 표시된 테이프를 그려진 외곽선을 따라 자르되, 접착제가 채널 내부로 돌출되지 않도록 직선으로 깔끔하게 절단하십시오. 이전 실험에서 유세포 분석셀 제작에 사용된 접착제를 제거하기 위해 아세톤을 사용하여 쿼츠 슬라이드를 철저히 세척하십시오.

채널 외곽선의 최적 정렬 위치를 찾습니다. 접착면의 한쪽 보호 필름을 제거하고 테이프를 코트 슬라이드 위에 조심스럽게 부착합니다. 입구와 출구 구멍이 막히지 않도록 테이프의 정렬에 주의하십시오.

다음으로, 플로우 셀의 유입구와 유출구에 사용할 0.76 millimeter 튜브의 절단 길이를 준비합니다. 튜브 끝을 약 30도 각도로 절단하면 튜브가 챔버 바닥에 밀착되어 눌리는 것을 방지할 수 있습니다. 다음 단계에서 플로우 셀에 쉽게 연결할 수 있도록 튜브를 시험관 랙에 걸어 둡니다.

이제 커버슬립 배양이 완료되었습니다. 스트렙타비딘 ENC가 코팅된 커버슬립을 물로 충분히 헹구고 압축 공기를 사용하여 건조하십시오. 한쪽 면만 기능화되었으므로 커버슬립이 뒤집히지 않도록 주의하십시오.

마지막으로, 테이프 뒷면의 나머지 부분을 제거하고 쿼츠 슬라이드를 커버 슬립 위에 올려 플로우 챔버 조립을 완료합니다. 커버 슬립을 가볍게 눌러 접착제에 갇힌 공기를 밀어냅니다. 이렇게 하면 플로우 채널 내에 기포가 발생하는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.

에폭시로 챔버의 측면을 밀봉합니다. 절단된 튜브를 쿼츠의 구멍에 삽입하고 에폭시로 고정하여 밀봉한 뒤 몇 분간 건조시킵니다. 에폭시 밀봉이 건조되면 표면 블로킹을 시작합니다.

21 gauge 바늘을 사용하여 Degas blocking buffer의 일부를 튜브 중 하나로 끌어당깁니다. 공기 방울을 제거하기 위해 여러 번 플러싱하고, 단일 분자 복제 실험으로 넘어가기 전에 챔버를 최소 30분 동안 인큐베이션합니다.

플로우 셀의 밀폐가 완료되면, 이를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 스테이지 클립으로 챔버를 고정하고 플로우 채널이 y축을 따라 정렬되었는지 확인하십시오. 더 큰 직경의 연결 튜브를 사용하여 플로우 셀 배출 튜브를 시린지 펌프에 연결합니다.

입구를 블로킹 버퍼에 넣고 시린지를 뒤로 당겨 튜브 내의 공기를 제거합니다. 유출 튜브를 가볍게 튕겨주면 플로우 셀에 갇힌 기포를 제거하는 데 도움이 됩니다. 이제 DNA를 첨가합니다. 스톡 DNA 템플릿을 블로킹 버퍼 1 mL에서 25 pM으로 희석하여, DNA가 표면에 충분히 덮일 수 있도록 0.025 mL/min과 같은 적절한 유속으로 30분 동안 챔버로 흘려보냅니다.

DNA가 챔버 내에 들어가면, 블로킹 버퍼 세척액을 사용하여 최소 200 flow cell volumes만큼 과잉 DNA를 세척해 냅니다. 모든 유리 DNA를 제거하기 위해 레이저와 카메라를 켭니다. 냉각된 CCD는 사용 전 해당 온도에 도달해야 합니다.

과량의 DNA를 세척하고 복제 버퍼를 탈기시킨 후, 뉴클레오타이드, DTT, cytoxin 및 복제 버퍼를 사용하여 복제 반응 혼합액을 준비합니다. 그다음 단백질을 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 이후 반응 혼합액을 플로우 셀로 흘려보냅니다.

여기서 유속은 너비 2 mm, 높이 100 µm의 유체 채널에서 이중 가닥 DNA를 신장시키기에 충분해야 합니다. 0.04 mL/min의 유속이 적절합니다. 혼합물이 챔버로 들어갈 수 있도록 약 10분 정도 시간을 둡니다.

시야를 채널 측면으로 이동시킨 후 접착제 물질에 초점을 맞추어, 초점 조절을 위해 표면 근처에 있는지 확인하고 이미징을 시작합니다. 레이저 출력, 현미경 초점 및 turf 각도를 조정하십시오. 염색된 DNA의 광분해(photo cleavage)를 방지하기 위해 출력은 낮게 유지하십시오.

DNA 복제 속도에 따라 초당 1~5프레임의 속도로 수 분 동안 획득하십시오. 더 긴 복제 궤적을 얻으려면 과정을 반복하거나, 반응 혼합물의 거의 모든 분자가 세포 내로 펌핑되었을 때 다른 시야를 확인하기 위해 cyt가 포함된 버퍼를 더 흘려보내 새로운 시야로 이동하십시오. 서로 다른 복제 분자들의 이미지를 여러 장 촬영하면 생산성 결정에 필요한 통계 데이터를 얻을 수 있습니다.

롤링 서클 복제 분석에서, 선도 가닥 합성은 원과 표면을 연결하는 꼬리 부분을 연장합니다. 이 꼬리는 지연 가닥 중합효소에 의해 이중 가닥 DNA로 전환되며, 층류에 의해 늘어난 모습이 표시됩니다. 여기 532 nanometer 들뜸 파장에서의 Cy3 orange 시야 예시가 있습니다.

작은 형광 점들은 결합된 비복제 기질들입니다. 생성물의 극도로 긴 길이와 시야당 생성물의 많은 수에 주목하십시오. 전형적인 시야에서는 염색된 DNA가 밝은 선 형태로 성장하며 복제되는 수많은 분자들이 관찰됩니다. 37 °C에서 수행한 E Coli 실험에서는 표면 밀도에 따라 시야당 5~50개의 분자가 나타납니다.

T7 복제 영역은 훨씬 더 효율적으로 개시되며, 한 시야 내 분자의 50% 이상을 복제합니다. 이처럼 밀도가 높으면 여기에서 보는 것과 같이 개별 분자를 분해하여 관찰하기 어렵습니다. 따라서 T7 실험은 더 낮은 단백질 농도나 표면 밀도에서 수행하십시오. e coli 및 T7 실험에서 나타나는 전형적인 복제 분자의 Chime 그래프에는 시간에 따라 도식화된 e coli 및 T7 분자의 최종점 궤적이 포함되어 있습니다. 이 궤적들은 선형 회귀 분석을 통해 복제 속도를 산출하며, 본 예시에서 복제 속도는 e coli의 경우 초당 467.1 base pairs이고, T7의 경우 초당 99.4 base pairs입니다.

T7의 경우, 단일 분자 궤적의 속도 분포를 단일 가우시안으로 피팅한 결과, e coli는 초당 535.5 ± 39 base pairs, G7은 초당 75.9 ± 4.8 base pairs의 평균값을 나타냈습니다. T7의 복제 생성물 길이 분포를 단일 지수 감쇠로 피팅하여 생산성을 구한 결과, e coli는 85.3 ± 6.1 kilobase pairs, G7은 25.3 ± 1.7 kilobase pairs로 나타났습니다. 지금까지 단일 분자를 이용하여 협동적 DNA 복제를 측정하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, 커버 슬립을 적절하게 기능화하고 깨끗하고 곧은 유로(flow channel)를 만드는 것이 중요합니다. 레이저 출력 부하를 낮게 유지하여 긴 DNA의 광절단(photo cleavage)을 최소화하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.