효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

이 영상에서는 광시야 광학 현미경을 이용해 선형화 및 화학적 변형이 이루어진 lambda DNA의 복제를 시각화하는 프로토콜을 보여줍니다. DNA는 기능화된 유리 커버슬립에 부착됩니다. DNA의 자유 말단은 비드로 표지되며, 층류를 통해 DNA를 신장시킵니다.

복제가 시작되면, 선도 가닥(leading strand)은 길어지기 시작하고 지연 가닥(lagging strand)은 코일링으로 인해 짧아집니다. 낮은 힘 조건에서 이중 가닥 DNA와 단일 가닥 DNA 사이의 상당한 길이 차이가 있기 때문에 복제 중 DNA 전환 과정을 직접 관찰할 수 있습니다. 비드의 위치를 추적하여 DNA 구조체의 길이를 모니터링함으로써 DNA 복제의 속도와 과정을 정밀하게 결정할 수 있습니다.

안녕하세요, 하버드 의과대학 생물화학 및 분자약리학과의 Anto one Vanian 및 Charles Richardson 연구실의 Ari Ulrich입니다. 오늘은 단일 분자 수준에서 DNA 복제를 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 DNA 합성과정 중에 일어나는 효소 활성을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작해 보겠습니다. 이 절차의 시작 단계에서, 선형화된 박테리오파지 Lambda DNA는 어닐링된 올리고뉴클레오타이드를 통해 복제 포크(replication fork), lambda 상보적 포크 암(complementary fork arm), 비오틴화된 포크 암(biotinylated fork arm) 및 포크 프라이머(fork primer)를 형성하도록 변형됩니다. 비오틴화된 포크 전암(forearm)은 5' 말단에 비오틴이 부착되어 있어, DNA 템플릿을 플로우 셀 표면에 고정할 수 있게 합니다.

lambda DNA는 비드 부착을 위한 고친화도 면역 태그 역할을 하는 diggen 및 moiety를 포함하는 또 다른 올리고뉴클레오타이드를 어닐링하여 추가로 변형합니다. 복제 포크를 생성하려면, 이 비디오에 수반되는 서면 프로토콜에서 서열을 확인할 수 있는 여러 올리고뉴클레오타이드와 함께 lambda DNA를 준비하십시오. 이러한 올리고뉴클레오타이드에는 비오틴화된 포크 암(fork arm), lambda 상보적 포크 암, 포크 프라이머 및 lambda 상보적 diggen 끝단이 포함되며, T4 polynucleotide kinase를 사용하여 lambda 상보적 포크 암과 lambda 상보적 diggen 끝단의 5' 말단을 인산화합니다.

다음으로 인산화된 lambda 상보적 포크 암(complementary fork arm), 비오틴화된 포크 암, 포크 프라이머, 그리고 lambda DNA를 10:10:100:1의 몰비로 혼합합니다. T4 DNA Ligase 버퍼 내에서 혼합물을 65 °C로 5분 동안 가열한 후, 히트 블록의 전원을 꺼서 실온까지 천천히 냉각함으로써 올리고뉴클레오타이드와 T4 DNA ligase가 혼합물에 적절히 어닐링(annealing)되도록 하고 2시간 동안 인큐베이트합니다. 실온에서 T4 DNA Ligase는 올리고뉴클레오타이드와 lambda DNA 사이의 닉(nick) 부분을 봉합하는 반응을 촉매합니다.

마지막으로, 인산화된 lambda complementary digoxigenin 말단을 T4 Ligase 버퍼 내에서 DNA 복제 템플릿에 첨가하여 결합시키십시오. 혼합물을 45 °C에서 30분 동안 배양한 후, 히트 블록의 전원을 꺼서 실온으로 서서히 냉각하십시오. 혼합물에 T4 DNA ligase를 첨가하여 인산화된 Lambda complementary digoxigenin 말단을 DNA 복제 템플릿에 연결하고 실온에서 2시간 동안 배양하십시오. 이제 최종 DNA 복제 템플릿이 사용할 준비가 되었습니다. tassel 활성화 자성 비드를 DNA 복제 템플릿에 부착하기 위해서는, digoxigenin에 특이적인 FAB 단편으로 기능화해야 합니다.

이 과정을 시작하려면, 비드 스톡 솔루션을 재현탁하고 400 µL를 에펜도르프 튜브에 옮깁니다. 튜브를 자석 분리기에 넣고 용액이 투명해질 때까지 배양합니다. 그런 다음 피펫팅을 통해 상청액을 제거합니다. 항체 결합을 위해 토알 그룹을 활성화하려면, 1 mL의 결합 버퍼를 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 섞어줍니다.

다시 한번 마그네틱 분리기를 사용하여 상층액을 제거합니다. 다음으로, 240 µL의 FAB fragment를 첨가하고 400 µL의 borate buffer에 비드를 재현탁합니다. 충분히 혼합한 후, 로테이터에서 37 °C로 16~24시간 동안 배양합니다.

배양 후, 자성 분리기를 사용하여 비드를 분리하고 상층액을 제거합니다. 1 mL의 세척 완충액으로 비드를 세척하고 4 °C에서 5분 동안 배양한 후, 자성 분리기를 사용하여 완충액을 제거합니다. 이 세척 과정을 2회 반복합니다.

유리 토실기(tosil group)를 차단하기 위해, Tris 완충액이 포함된 BSA 1 mL를 첨가하고 37 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 배양 후, 자성 분리기를 사용하여 비드에서 완충액을 제거하고 완충액으로 두 번 세척한 다음 분주합니다. 사용을 위해, 복제될 DNA를 Amil lane으로 기능화된 유리 커버슬립에 부착합니다.

Amil lane의 oxy 그룹이 유리에 결합하여, 비오틴화된 peg 분자와 결합할 수 있는 아민이 노출됩니다. 이러한 코팅은 표면에 대한 비특이적 결합을 줄이는 데 도움이 됩니다. 유리 커버슬립을 철저히 세척하려면, 커버슬립을 염색병에 넣고 병에 에탄올을 채운 후 초음파 세척하십시오.

30분 동안 병을 헹구고 1 M 수산화칼륨 용액을 채운 후 30분 동안 초음파 세척하며, 이 두 세척 과정을 반복합니다. 첫 번째 기능화 반응을 위해 모든 수분 흔적을 제거해야 합니다. 염색 병에 아세톤을 채우고 10분 동안 초음파 세척합니다.

병을 비우고 다시 아세톤으로 채웁니다. 병에 sine 시약을 첨가하고 2분 동안 교반합니다. 그 후 과량의 물을 가하여 반응을 정지시킵니다.

그 다음 커버슬립을 오븐에서 110 °C로 30분 동안 가열하여 건조시킵니다. 다음으로, 약 0.2% w/v 농도의 peg 혼합물을 준비합니다. 유리 커버슬립 스페이서를 포함한 비오틴화 peg는 커버슬립의 분리를 가능하게 하므로, 건조된 실릴화 커버슬립 위에 100 µL를 피펫으로 분주합니다.

그 위에 두 번째 커버슬립을 덮습니다. 커버슬립을 PEG 용액에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 커버슬립 쌍을 분리하고 물로 충분히 세척합니다.

커버슬립의 한쪽 면에만 PEG가 코팅되므로, 기능화된 면이 위를 향하도록 주의하십시오. 마지막으로, 압축 공기로 커버슬립을 건조시킨 후 진공 데시케이터에 보관하십시오. 표면은 최소 한 달 동안 안정적으로 유지됩니다. 따라서 수십 개의 커버슬립을 한 번에 제작하여 필요할 때마다 사용할 수 있습니다.

커버 슬립이 준비되었으므로, 단일 분자 실험을 위한 유동 챔버를 조립할 수 있습니다. 단일 분자 실험은 기능화된 커버 슬립, 양면 테이프, 쿼츠 슬라이드 및 튜빙으로 구성된 간단한 유동 챔버를 사용하여 수행됩니다. 각 단일 분자 실험마다 하나의 유동 챔버를 준비합니다.

먼저 블로킹 버퍼 5 mL와 워킹 버퍼 20 mL를 혼합한 후, 이후 단계에서 사용할 공기 방울을 제거하기 위해 혼합물을 데시케이터에 넣습니다. 다음으로, PBS에 녹인 strp din 워킹 솔루션 100 µL를 펙(peg) 기능화된 커버슬립 표면에 도포하고, strp din이 표면 비오틴에 결합할 수 있도록 상온에서 20분 동안 배양합니다. 그동안 쿼츠 슬라이드 크기에 맞춰 양면테이프를 자르고 테이프 위에 튜빙 구멍의 위치를 표시합니다.

중앙 채널의 너비를 3mm로 설정하고 두 구멍이 모두 포함되도록 직사각형으로 흐름 챔버(flow chamber)의 외곽선을 그립니다. 흐름 챔버는 두 개의 입구와 두 개의 출구가 있는 Y자형 채널로 설계할 수 있습니다. 이제 표시된 테이프를 따라 외곽선을 자르되, 접착제가 채널 내부로 돌출되지 않도록 직선으로 깔끔하게 절단합니다.

이전 실험에서 사용한 플로우 셀 제작 시 묻은 접착제를 제거하기 위해 아세톤을 사용하여 쿼츠 슬라이드를 철저히 세척하십시오. 채널 윤곽의 최적 정렬 위치를 찾으십시오. 접착 뒷면의 한쪽 면을 제거하고 테이프를 쿼츠 슬라이드 위에 조심스럽게 부착하십시오.

입구와 출구 구멍이 막히지 않도록 테이프를 정확하게 정렬하십시오. 다음으로, 플로우 셀의 입구와 출구에 사용할 내경 0.76 millimeter 튜브를 적절한 길이로 절단하여 준비합니다. 튜브가 챔버 바닥에 완전히 밀착되지 않도록 튜브 끝을 약 30도 각도로 절단하십시오.

다음 단계에서 플로우 셀에 쉽게 연결할 수 있도록 튜브를 시험관 랙에 걸어 둡니다. 이때쯤이면 커버 슬립 배양이 완료되었을 것입니다. 커버 슬립을 물로 충분히 헹군 후 압축 공기를 사용하여 건조시킵니다.

커버슬립의 한쪽 면에만 peg가 기능화되어 있으므로, 커버슬립을 뒤집지 않도록 주의하십시오. 테이프 뒷면의 나머지 부분을 제거하고 쿼츠 슬라이드를 커버슬립 위에 올려 플로우 챔버 조립을 완료합니다. 커버슬립을 가볍게 눌러 접착제에 갇힌 공기를 밀어내십시오. 이렇게 하면 유로에 기포가 들어가는 것을 방지할 수 있습니다.

에폭시를 사용하여 챔버의 측면을 밀봉하십시오. 절단된 튜브를 석영의 구멍에 삽입하고 에폭시로 고정하여 밀봉하십시오. 몇 분 동안 건조시키십시오.

건조가 완료되면, 21 gauge 바늘을 사용하여 DGA 블로킹 버퍼의 일부를 튜브 중 하나로 끌어당겨 챔버 표면을 블로킹합니다. 기포를 제거하기 위해 몇 번 씻어낸 후, 단일 분자 복제 실험으로 넘어가기 전 챔버를 최소 30분 동안 인큐베이션합니다. DNA 템플릿이 기능화된 비드와 유동 챔버가 준비되면 단일 분자 실험을 수행할 수 있습니다.

먼저, 플로우 셀을 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 스테이지 클립으로 챔버를 고정하고, 플로우 채널이 CCD 카메라와 일직선으로 정렬되었는지 확인하십시오. 이전에 제작한 에어 스프링을 시린지 펌프와 플로우 셀의 배출 튜브에 연결하십시오.

더 큰 직경의 커넥터 튜브를 사용하여 플로우 셀의 유입 튜브를 블로킹 버퍼에 넣고, 시린지를 뒤로 당겨 튜브 내의 공기 방울을 제거한 후, 유출 튜브를 가볍게 튕겨 플로우 셀 내에 갇힌 공기 방울을 제거합니다. 모든 공기 방울이 제거되면 유입 튜브 중 하나를 바늘로 막고, 유출 튜브 중 하나를 180도로 꺾어 접착 테이프로 고정하여 밀봉합니다. 셀에 DNA를 첨가하기 전, 스톡 DNA 템플릿을 1 mL의 DGAs 1x 블로킹 버퍼에 희석하여 10 pM 농도로 만듭니다. DNA가 표면에 충분히 덮일 수 있도록 적절한 유속으로 템플릿을 챔버로 흘려보냅니다.

스톡 비드 용액을 1 mL의 DGAs 1x 블로킹 버퍼를 사용하여 mL당 2~4 × 10⁶개의 비드가 되도록 희석합니다. 그런 다음 혼합물을 볼텍싱하고 20초 동안 초음파 처리합니다.

희석된 비드 용액을 챔버로 흘려보냅니다. 비드가 추가되면 흐름을 차단하고 챔버가 평형 상태에 도달하도록 둡니다. 그런 다음 두 배출 튜브를 모두 닫습니다.

챔버를 닫지 않은 상태에서 튜브에 가해지는 모든 변경 사항은 압력 변동을 일으켜 비드에 강한 힘을 가하고 결합된 DNA 분자를 전단시킬 수 있습니다. 두 번째 유입 튜브를 사용하여 비드 로딩에 사용된 유입 튜브를 바늘로 막으십시오. 블로킹 버퍼 1배액 용액으로 플로우 셀을 충분히 세척하기 시작하십시오.

표면을 톡톡 두드려 스테이지를 흔들어 비특이적으로 부착된 비드를 제거한 후 확인하십시오. 비드는 DNA에 결합되어 있습니다. 흐름 방향을 변경해 보십시오.

유리 비즈가 충분히 제거되면 흐름을 차단하고 챔버가 평형 상태에 도달할 때까지 기다립니다. 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 복제 단백질이 포함된 신선한 반응 혼합물을 준비합니다. 열려 있는 배출 튜브를 닫고 유입 리저버를 새로 준비한 반응 혼합물로 전환합니다.

효소 반응을 진행하기 위해 급격한 압력 변화를 방지하며 배출구를 천천히 엽니다. 먼저, 단백질 용액이 DNA에 효율적으로 결합할 수 있도록 적절한 유속으로 챔버에 흘려줍니다. 흐름을 중단하고 챔버가 평형 상태에 도달할 때까지 기다립니다.

배출 튜브를 닫고 반응 혼합물이 담긴 튜브로 교체합니다. DGAs 세척 완충액이 담긴 튜브를 사용하여 세척 후 챔버 내의 유리 단백질을 제거하기 위해 세척합니다. 다시 흐름을 중단하고 챔버가 평형 상태에 도달하도록 기다립니다.

배출 튜브를 닫고 세척 버퍼가 들어 있는 튜브를 교체하십시오. T7 복제 버퍼가 든 튜브를 사용하며, T7 복제 버퍼에는 복제 반응의 시작을 유도하는 염화마그네슘이 포함되어 있습니다. 본 프로토콜에 기술된 조건을 사용하여 DNA 테더에 3 pN의 항력(drag force)에 해당하는 0.012 mL/min의 유속을 적용하십시오.

비드와 표면 사이의 비특이적 상호작용을 방지하기 위해, 이미징 전 유동 셀(flow cell) 위에 희토류 영구 자석을 배치하십시오. 10배 대물렌즈와 CCD 카메라의 현미경 시야 근처에 광섬유 조사기를 배치하고, 입사각을 10도에서 현미경 스테이지와 평행한 범위 사이로 조절하십시오. 테더드 비드(tethered bead)를 사용하여 비드 이미징 초점의 대비를 높이기 위해 암시야 조명을 사용합니다.

낮은 프레임 속도로 20분에서 30분 동안 데이터 획득을 시작하십시오. 실험이 성공적이라면, 100개의 비드(bead)를 동시에 관찰할 수 있습니다. 실험 결과로 선도 가닥 DNA 합성을 보여주는 수많은 트레이스가 생성되어야 합니다.

DNA 풀림(unwinding) 및 중합(polymerization)의 속도와 프로세시비티(processivity)를 측정하기 위해서는 비드의 정확한 위치를 결정해야 합니다. 이러한 위치를 2차원 가우시안 함수로 피팅하십시오. 트래킹 소프트웨어를 사용하여 각 프레임에서 비드의 위치를 추적함으로써 궤적을 시각화하십시오.

그런 다음, 그래픽 소프트웨어를 사용하여 시간에 따른 비드 위치를 플롯하여 속도 데이터를 얻습니다. 플롯에 선형 회귀 분석을 적용하고 프로세시비티(processivity)를 위한 기울기를 계산합니다. 단축 이벤트의 시작부터 끝까지 DNA의 전체 길이를 결정합니다.

모든 단일 측정값을 결합하고, 가우시안 함수와 단일 지수 함수를 사용하여 각각 데이터에 적합한 속도 및 생산성 분포를 그래프로 나타냅니다. 지금까지 단일 분자 수준에서 DNA 복제의 속도와 프로세시비티(processivity)를 측정하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 층류(lamina flow)에 의한 힘과 특정 비드(beads)가 복제 단백질의 효소 활성에 영향을 미치지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운이 깃들길 바랍니다.