대동맥 링 분석

대동맥 링 분석(aortic ring assay)의 전반적인 목적은 3D 매트릭스 내에서 마우스 대동맥 전체 조각으로부터 혈관이 발아하는 유연한 실험 시스템을 제공하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스에서 흉부 대동맥을 박리한 후, 주변에 남아 있는 조직을 조심스럽게 제거하여 세척합니다. 세척된 대동맥의 단면 또는 대동맥 링을 돔 형태로 성형된 기초 매트릭스 추출물(basal matrix extract) 또는 BME가 들어 있는 48-웰 플레이트의 개별 웰에 배치합니다.

BME 한 방울을 추가로 떨어뜨려 링을 3D 구조 내에 가둡니다. 매트릭스에는 선택한 임의의 실험 시약을 포함할 수 있습니다. 수일간 배양 후, 대동맥 링에서 혈관이 생성되는 것을 관찰할 수 있으며, 테스트 화합물의 혈관 형성 잠재력을 평가할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 이스라엘 베에르셰바에 위치한 네게티브 베온 대학교 임상 생화학과의 E. Lewis 박사 연구실 소속 Karen Bein입니다. 오늘은 마우스 대동맥 링 분석법(mouse aortic ring assay) 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 혈관 형성에 미치는 다양한 물질의 효과를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 기저막 추출물(basement matrix extract, BME)을 얼음 위 또는 4 °C에서 해동하십시오. 해동 후에는 BME가 다시 응고되는 것을 방지하기 위해 계속 차갑게 유지하십시오.

실험 당일에 6~7주령의 마우스를 표준 케타민 및 자일라진 주입법으로 안락사시킨 후, 경동맥을 통해 빠르게 방혈하고 경추 탈구를 실시합니다. 멸균 라미나 플로우 후드 내에서 70% ethanol로 동물을 닦아내어 절차를 시작합니다. 다음으로, 해부 현미경 하에서 멸균 핀셋과 해부용 가위를 사용하여 피부를 수직으로 절개하고 복벽을 엽니다.

늑골을 절개하고 횡격막을 제거하여 흉골 상단이 노출되도록 절개해야 합니다. 모든 장기를 조심스럽게 옆으로 밀어 척추를 따라 위치한 흉부 대동맥을 완전히 노출시킵니다. 대동맥이 노출되면 대동맥과 척추 사이에 얇은 멸균 핀셋을 삽입합니다. 핀셋을 벌려 대동맥을 서서히 들어 올려, 흉부 분절을 나머지 대동맥 부분과 분리합니다.

대동맥이 분리되었으면, 날카로운 가위를 사용하여 신혈관과 가까운 끝부분부터 시작하여 심장 근처까지 절개하여 마우스로부터 제거합니다. 적출한 흉부 대동맥을 차가운 멸균 PBS가 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 대동맥이 제거되었으므로, 이제 이안현미경 하에서 두 개의 멸균 핀셋을 사용하여 대동맥 링을 준비할 수 있습니다.

흉부 대동맥 주변의 지방 조직을 제거합니다. 대동맥이 손상되지 않도록 주의하며 가장자리 부분만 잡고 조작하십시오. 최종적으로 세척이 완료될 때까지 대동맥의 탈수를 방지하기 위해 PBS가 담긴 페트리 접시에 반복적으로 담가 두어야 합니다.

흉부 대동맥을 깨끗하게 세척한 후, 수술용 칼을 사용하여 실체 현미경 하에서 대동맥을 1 mm 두께의 고리 모양으로 균일하게 자릅니다. 절단면 아래에 놓인 자를 가이드로 삼아 절단하며, 예리함을 유지하기 위해 새 칼날을 사용하고 주기적으로 교체하십시오. 대동맥의 양 끝단은 사용하지 않습니다. 각 고리를 자른 후에는 핀셋을 사용하여 차가운 PBS가 담긴 새 접시에 매우 조심스럽게 옮깁니다.

분석의 무작위성을 보장하기 위해 모든 링을 동일한 PBS 포함 플레이트에 넣으십시오. 대동맥의 각 분절은 혈관 형성 잠재력이 어느 정도 다르므로, 링을 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 분석 플레이트를 준비하십시오.

48-웰 플레이트의 각 웰에 차가운 BME 약 150 µL를 첨가합니다. 이때 BME 방울은 투하 도중 돔 형태로 응고됩니다. BME는 물질의 수송과 세포의 화학성 유인, 그리고 가장 중요하게는 신생 혈관 형성으로 이어지는 세포 분화와 이동을 가능하게 합니다. BME의 탈수를 방지하기 위해 외곽 웰은 PBS로 채우고, BME 방울이 37 °C에서 20~30분 동안 응고되도록 둡니다. BME가 응고되면 핀셋을 사용하여 페트리 접시에서 대동맥 링을 조심스럽게 들어 올립니다. 손상을 방지하기 위해 링은 핀셋 팁 사이에 형성된 지질 방울 내부에 위치시켜 옮겨야 합니다. 액체의 표면 장력을 이용하여 각 돔의 상단 중앙에 대동맥 링 하나를 배치하고 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 각 링의 위에 BME 150 µL를 추가로 첨가하고 20~30분 동안 배양합니다.

37°C에서 링이 BME로 둘러싸였으며 이제 분석이 가능합니다. 분석을 시작하기 위해 플레이트에 재료를 추가할 수 있습니다. 이전에 준비한 인간 혈관 내피 세포 무혈청 배지에 실험 재료 또는 음성 대조군에 대한 양성 대조군으로 혈관 내피 세포 성장 보충제를 보충하십시오.

배지만을 사용합니다. 각 웰에 보충제가 포함된 배지 500 µL를 추가하고 37 °C에서 6~12일 동안 배양합니다. 이 배양 기간 동안 현미경으로 플레이트를 관찰하여 대동맥에서 뻗어 나오는 혈관과 추가적인 분지 혈관으로 확인되는 고도로 성숙한 혈관이 있는지 확인합니다.

표준 위상차 실체 현미경을 사용하여 6일에서 12일 사이에 고리 조직으로부터 3차원으로 뻗어 나오는 고리를 촬영해야 합니다. 또한, 6일에서 12일 사이의 다양한 날짜에 상층액을 수집하여, 하루 이내에 사용할 경우 4°C에 보관하고 향후 사용할 경우 -20°C 또는 -80°C에 보관하십시오. 상층액은 vgf에 대한 ELISA 또는 산화질소 수치 측정을 위한 Griess assay와 같은 다양한 기술로 분석할 수 있습니다.

이 이미지들은 웰에 링을 배치하고 상단 행의 이미지에 보이는 배지 또는 하단 패널에 보이는 혈관 발아의 양성 대조군으로 사용된 ECGS와 함께 배양한 지 12일 후에 수집되었습니다. 각 이미지는 조건당 분석에 통상적으로 사용되는 12개의 링 중 4개의 대표적인 스냅샷입니다.

각각의 별도 웰에 있는 각 대동맥 링의 모서리는 검은색입니다. 이렇게 촬영했을 때, ECGS에 노출된 대동맥 링은 혈관 성장을 보이며, 화살표는 형성된 수많은 혈관 중 몇 가지를 가리킵니다. 각 혈관은 내피세포의 사슬 형태로 특징지어지며, 때때로 분지(branching)가 나타나는 것은 이들이 성숙했음을 나타냅니다.

배양물에서 발아 혈관이 관찰되지 않습니다. 상단 패널의 배지 웰입니다. 지금까지 이 절차를 통한 대동맥 원형 분석법의 수행 방법을 보여드렸습니다. 정확하게 작업하고 멸균 조건을 유지하는 것이 중요함을 기억하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.