자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

본 절차의 전반적인 목표는 기능 분석에 사용할 수 있도록 응집된 세포와 세포 유래 매트릭스로부터 3D 조직 구조체를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 폴리카보네이트 몰드를 밀링하여 바닥이 둥근 환형 웰을 제작함으로써 수행됩니다. 그다음, 폴리디메틸실록산(PDMS)을 폴리카보네이트 몰드 위에 캐스팅하여 템플릿을 제작합니다.

그런 다음 PDMS 템플릿을 사용하여 aros 웰을 형성합니다. 마지막 단계는 aros 웰에 세포를 파종하여 세포들이 응집되고 응집력 있는 조직 링을 형성하도록 하는 것입니다. 궁극적으로 이 방법은 다양한 세포 유형을 사용하여 세포 자가 조립 및 조직 공학을 달성하는 데 활용될 수 있으며, 세포와 세포 유래 세포외 기질이 조직의 구조와 기능에 기여하는 바를 분석할 수 있게 해줍니다.

이 기술이 다른 조직 공학 접근 방식보다 갖는 주요 장점은, 이전 보고보다 더 빠르게 세포와 세포가 생성하는 세포외 기질만으로 조직 구조물을 생성할 수 있으며, 기계적 분석에 유리한 형태로 제작 가능하다는 점입니다. 먼저, 0.5인치 두께의 폴리카보네이트 조각을 밀링하여 중심 기둥 직경이 2mm인 15개의 원형 바닥 환형 웰을 제작합니다. 밀링 과정에서 발생한 플라스틱 파편을 제거하기 위해 폴리카보네이트 몰드를 세척하고 건조시킵니다. 다음으로, PDMS를 베이스와 경화제 비율 10:1로 혼합합니다. 용액 내의 모든 기포를 제거하기 위해 탈기 과정을 거친 후, 이를 폴리카보네이트 몰드에 붓습니다.

그 후, 몰드 위의 혼합물을 다시 탈기하여 남아 있는 기포를 제거하고, 60 °C의 오븐에서 4시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. PDMS가 경화되는 동안 DMEM에 2% AROS를 용해합니다. 경화가 완료되면 폴리카보네이트에서 천천히 떼어내어 PDMS 템플릿을 조심스럽게 제거한 다음, 비눗물로 PDMS를 세척하고 DMEM AROS 용액과 함께 오토클레이브합니다. 이제 오토클레이브한 PDMS 템플릿을 평평한 표면에 놓고, 먼저 각 중앙 포스트 몰드에 AROS를 피펫팅한 다음 그 주변 공간에 AROS를 피펫팅하여 용융된 AROS로 채웁니다.

aros가 약 15분 동안 굳을 때까지 기다립니다. 그다음 몰드를 뒤집어 PDMS에서 aros를 분리합니다. 각 웰 주변의 과잉 aros를 잘라내고, 12-웰 플레이트의 각 웰에 aros 웰을 하나씩 배치합니다.

웰의 상단을 덮지 않도록 주의하며 aros 웰 바깥쪽에 세포 배양 배지를 추가합니다. 그 후, 세포를 준비하는 동안 평형 상태에 도달할 수 있도록 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 90% confluence에 도달하면 쥐 대동맥 평활근 세포를 trypsin 처리하고 재현탁합니다.

세포를 5 × 10⁶ cells/mL 농도로 부유시킵니다. 그런 다음 평형화된 aros 웰 각각에 재부유된 세포 현탁액 100 µL를 피펫으로 분주합니다. 이때 원을 그리듯 움직여 세포를 각 웰에 도포합니다.

플레이트를 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 그대로 둡니다. 2일에 한 번씩 웰 주변의 배지를 흡입하여 제거한 후, aros 몰드가 완전히 잠길 때까지 각 웰을 다시 채워 배지를 교체합니다. 배양 종료 시, 작은 페트리 접시에 PBS를 채웁니다.

각 링을 중앙 포스트 상단으로 밀어 올려 aros 몰드에서 제거합니다. 링을 PBS가 담긴 페트리 접시에 넣고, 디지털 이미징 시스템 아래에 링을 배치합니다. 에지 검출 소프트웨어를 사용하여 링 둘레의 상단, 하단, 좌측, 우측 등 네 군데 지점에서 링의 두께를 측정합니다.

단축 인장 시험을 수행합니다. 링 샘플을 두 개의 가는 와이어 그립에 장착합니다. 링에 5 mN의 인열 하중이 가해질 때까지 그립을 늘립니다.

그 다음, 두께 측정값으로부터 계산된 단면적을 입력하고 표점 거리를 기록합니다. 링을 파단 하중과 50 kilo pascal 사이에서 8회 사전 사이클링합니다. 8번째 사전 사이클링 후, 10 millimeters per minute의 속도로 응력을 가해 10 millimeters per minute의 속도로 파단될 때까지 당깁니다.

각 링에 대해 극한 인장 응력과 파단 변형률을 측정하고, 획득한 데이터로부터 최대 접선 계수를 계산합니다. 기능적 in vitro 연구 외에도, 이러한 살아있는 세포 링들은 융합하여 조직 튜브를 형성할 수 있습니다. 수술용 가위로 실리콘 튜브의 끝부분을 비스듬히 잘라 베벨 엣지를 만든 다음, 실리콘 튜브를 오토클레이브하여 멸균합니다.

페트리 접시에 배지를 채웁니다. 멸균된 맞춤형 실리콘 튜브 홀더를 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮겨 빈 페트리 접시에 놓습니다. 다음으로, aros 웰에서 링을 제거하여 배지가 채워진 페트리 접시에 넣습니다. 사용 전 실리콘 튜브를 적시기 위해 동일한 페트리 접시에 함께 넣습니다.

포셉을 사용하여 실리콘 튜브의 끝부분을 링의 중앙에 배치하고, 링을 실리콘 튜브 위로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 튜브를 따라 양방향으로 링을 순차적으로 가볍게 밀어 링들이 서로 접촉하도록 합니다. 링 장착이 완료되면, 폴리카보네이트 홀더 내에 실리콘 튜브를 정렬하고 홀더의 두 부분을 나사로 조여 결합합니다.

페트리 접시에 배지 55 milliliters를 넣습니다. 조직 튜브를 제거하기 위해 배양 기간 동안 3일마다 배지를 교체합니다. 먼저, 페트리 접시를 PBS로 채웁니다.

그다음 폴리카보네이트 홀더에서 실리콘 튜브를 분리하고, 핀셋을 사용하여 조직 튜브를 실리콘 튜브에서 밀어내어 디쉬로 옮깁니다. 정확하게 수행되면, 세포가 aros 웰 바닥에 가라앉고 안착 후 24시간 이내에 수축하여 Agarro s 웰의 중앙 포스트 주변에 조직 링을 형성합니다. 이것은 쥐 평활근 세포로 생성된 2 mm 조직 링의 단축 인장 시험에서 얻은 응력-변형률 곡선의 대표적인 그래프입니다. 이후 극한 인장 강도, 최대 인장 탄성률 및 파단 변형률 값을 사용하여 서로 다른 배양 파라미터 하에서 성장한 조직 링 샘플의 기계적 특성을 비교합니다.

조직 링의 기계적 특성은 세포 정착 수, 배양 기간, 배양 배지 및 사용된 세포 유형을 포함한 배양 파라미터를 변경하여 조절할 수 있습니다. 쥐 평활근 세포 외에도, 인간 일차 평활근 세포는 유사한 인장 강도를 가진 조직 링을 형성합니다.

인간 중간엽 줄기세포 또한 응집되어 링 형태를 형성하지만, 기계적 테스트를 수행하기에는 강도가 충분하지 않았습니다. 본 시스템은 맞춤형 aros 웰에 세포를 시딩하는 것만으로 세포만을 이용해 공학적 조직 구조물을 제작할 수 있게 합니다. 초기 폴리카보네이트 몰드가 가공되고 나면, 이를 이용해 PDMS 템플릿을 무제한으로 제작하여 몰드를 만들 수 있으므로 추가 장비가 필요하지 않습니다.

이 시스템은 조직 링을 제작하기 위해 다양한 세포 유형을 적용해 왔을 만큼 다재다능하므로, 조직 공학 응용 분야뿐만 아니라 조직의 구조와 기능에 있어 세포 및 세포외 기질의 기여도를 분석하는 인비트로(in vitro) 연구 모두에 잠재적으로 활용될 수 있습니다.