의 삼투 회피 Caenorhabditis 엘레간스 : 두 유전자의 시냅틱 기능, 인간의 Orthologues NRXN1과 NLGN1로 후보

안녕하세요, 저는 스페인 코르도바 대학교 유전학과의 Manuel Ruiz Rubio입니다. 저희는 완전히 규명된 C. elegans의 신경계를 활용하여, 자폐증 연구를 위한 실험 도구로 이 선충을 사용하고 있습니다. 저희는 신경 시냅스에 관여하며 자폐증과 연관된 것으로 알려진 유전자에 결함이 있는 선충 돌연변이체를 연구하고 있습니다.

Neurexins과 neuroligins는 시냅스에 존재하는 막 접착 분자입니다. C. elegans의 머리에는 삼투압을 포함한 다양한 자극에 대한 반응을 매개하는 선충의 감각 기관인 amphid가 있습니다. Amphid는 섬모 수지상 돌기와 하나의 시냅스 전 말단 축삭을 가진 12개의 감각 양극 뉴런으로 구성됩니다.

이러한 뉴런 중 ASHR 및 ASHL이라 불리는 두 뉴런은 삼투압 감각 기능에서 특히 중요하며, 높은 삼투압을 가진 수용성 기피 물질을 감지합니다. 본 영상에서는 4M 과당 링 방법을 사용하여 시냅스 결함 돌연변이체의 삼투압 회피 반응을 측정하는 방법을 소개합니다.

neurexin과 neuroligin이 고삼투압 회피 반응에 미치는 영향을 평가하기 위해, 4 M fructose 용액 기반의 방법을 사용하여 nrx-1 및 nlg-1 유전자에 결함이 있는 C. elegans 돌연변이체의 서로 다른 반응을 보고하였습니다. 실험 당일에 1% Congo red가 포함된 4 M fructose 표준 용액을 조제하여 실온에서 완전히 용해시킵니다. NGM 플레이트의 고체 배지 중앙에 지름 1 cm의 원형 링을 형성합니다.

15 µL의 4M 과당 적색 용액을 사용합니다. 과당이 한천(agar)에 약 5분 동안 스며들게 합니다. 실험은 블라인드 방식으로 수행되어야 합니다. 분석 대상인 각 균주가 담긴 플레이트는 보조 실험자가 라벨을 부착해야 합니다.

SA는 표시되지 않은 이러한 표식들을 사용하여 수행합니다. 실험이 종료되기 약 24시간 전에 판매가 이루어지기 전, 각 유전형의 L4 유충을 선택하여 e coli 박테리아가 포함된 AFL NGM 플레이트로 옮기고 다음 날까지 20 °C에서 유지해야 합니다. 실험은 어린 성체(young adults)로 시작해야 합니다.

각 균주의 벌레를 개별적으로 휴식 원 내에 넣고, 각 개체가 tic 장벽에 반응하는 시간을 측정하며 관찰하십시오. 결론적인 결과를 얻기 위해 각 균주당 10마리의 개체와 최소 3회의 반복 실험을 수행해야 합니다. 빨간색 링을 6회 연속으로 회피하는 개체는 정상으로 분류합니다.

6회 미만의 시도 내에 링을 벗어나는 개체는 삼투압 민감성에 결함이 있는 것으로 간주하며, 각 SA Bristol 실험군마다 대조군을 사용해야 합니다. 또한 링 장벽을 피하는 두 마리의 동물을 양성 대조군으로 사용합니다. 대조군 균주는 4M fructose로 구성된 삼투압 장벽을 발견했을 때 후진하는 반응을 보입니다. 신경 결핍 돌연변이체는 고농도 삼투압에 대해 이와 유사한 행동을 보입니다.

그러나 NEUR 결핍 돌연변이체는 이러한 삼투압 장벽을 감지하지 못했습니다. 서로 다른 활성 neur 및 nout 대립유전자를 가진 이중 돌연변이체는 삼투압에 반응하는 야생형 표현형을 회복했습니다. RNA 간섭 공급을 통해 웜을 획득하기 위해, 표적 유전자에 해당하는 단편을 포함하는 L 44 40 벡터로 형질전환된 e coli HD 11 five 균주의 단일 콜로니를 분리합니다. 박테리아는 LBA 또는 carbonic 플레이트에 분리하여 다음 날까지 배양합니다.

박테리아 콜로니를 선택하여 LV 액체 배지에 접종합니다. 37°C에서 흔들어주며 약 7시간 동안 배양합니다. 이 배양액을 탄산염 층과 IPTG가 포함된 NGM 플레이트에 점적하고 상온에서 하룻밤 동안 방치하여 박테리아를 성장시키고 표적 유전자 단편의 발현 유도를 시작합니다.

RNA 간섭을 위해서는 양성 대조군과 비음성 대조군을 사용하는 것이 필요합니다. 급이 실험에서 음성 대조군은 동일합니다.

TL 44 40 벡터로 형질전환된 HT 11 5 균주입니다. 양성 대조군은 22 유전자 서열을 포함하는 L 44 40 벡터로 형질전환된 ELI HT 11 5 세포입니다. 이 유전자의 넉다운으로 인해 발생하는 shaking 표현형은 입체 현미경 하에서 쉽게 구별할 수 있습니다.

첫째 날. 박테리아가 포함된 NGM 플레이트에서 L4 단계의 벌레들을 박테리아와 Kuwait가 포함된 플레이트로 옮겨 20 °C에서 12시간 동안 둡니다. 이는 단식 기간입니다.

다음 날, 특정 RNA 간섭 표적 유전자를 발현하는 박테리아가 도말된 플레이트로 성장 빠른 청년기 성체(fast young adult)를 옮깁니다. F1 자손을 얻기 위해 20 °C에서 약 48시간 동안 배양합니다. 그 후, 다음 이틀 동안 동일한 박테리아가 도말된 다른 플레이트로 F1 성체 몇 마리를 옮깁니다.

F2 세대 자손 중에서 성체 초기 개체를 선택하여 분리합니다. Bristol N2 야생형 균주가 박테리아와 함께 배양된 상태에서 표현형을 평가합니다. L 44 40 벡터가 삼투압 장벽에서 뒤로 이동할 때 확인합니다.

C. elegans의 nrx-1 유전자 조각을 발현하는 박테리아를 공급받은 Bristol 및 true white 야생형 균주는 4M 농도의 용액을 감지하지 못했습니다. 반면, 삼투압 장벽을 감지하지 못하는 nrx-1 결핍 돌연변이체는 C. elegans의 nrx-1 유전자 조각을 발현하는 박테리아를 공급받았을 때 이 능력을 회복했습니다. 본 영상에서는 C. elegans의 삼투압 회피 반응에 영향을 미치는 유전자의 효과를 연구할 수 있는 간단한 방법을 소개합니다.

Congo Red과 함께 4M 과당 링을 사용하여 삼투압에 대한 반응을 분석합니다. neuroligin 결핍 변이체는 이러한 반응에 결함이 있는 반면, nrx-1 변이체는 삼투압 스트레스를 감지하는 능력이 손상되지 않아 야생형 균주와 유사한 반응을 보입니다. 이 영상에서는 nrx-1 및 nlg-1 유전자의 서로 다른 knockout 대립유전자를 가진 이중 변이체 균주가 삼투압에 반응하는 야생형 표현형을 회복하는 것을 보여줍니다.

이러한 관찰 결과는 RNA 간섭의 feeding lockdown 방식을 통해 확인되었습니다. 이러한 방식으로, 야생형 균주에 ING 유전자의 해당 서열을 발현하는 박테리아를 먹였을 때 삼투압 장벽을 인식하는 능력이 저하되었습니다. 반면, 4M fructose 용액을 감지하지 못하는 neur 결핍 돌연변이체는 NNU 유전자의 해당 서열을 발현하는 박테리아를 먹였을 때 이 행동이 회복되었습니다.

본 실험에서 나타난 결과는 nrx-1과 nlg-1이 선충의 감각 뉴런의 시냅스 연결에 관여할 수 있으며, 또한 시냅스 기능에 영향을 미치는 방식으로 서로 상호작용한다는 것을 나타냅니다. 이것으로 마치겠습니다. 여러분의 실험에 행운이 깃들길 바랍니다.