의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

이 프로시저의 전체적인 목적은 수많은 표현형 또는 대사 경로의 기초가 되는 유전자 발현 프로필을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 대조되는 두 가지 선충 균주로부터 mRNA를 분리함으로써 수행됩니다. 프로시저의 두 번째 단계는 S SI three 또는 SFI 캡처 서열을 포함하는 cDNA를 합성하고 이를 마이크로어레이에 하이브리드화하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 S SI 3 및 SCIFI 형광체가 포함된 항-포획 서열로 마이크로어레이를 하이브리드화하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 마이크로어레이를 스캔하고 magic tool 소프트웨어와 같은 생물정보학 도구를 사용하여 데이터를 분석하는 것입니다. 최종적으로, 조사 중인 생물학적 현상을 매개하는 후보 유전자가 식별되며, 이는 real-time PCR과 같은 대안적 기술을 통해 검증 및 정량화될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 스팟팅된 뉴클레오타이드가 눈에 보이지 않아 23,000개 이상의 고유하게 프린팅된 뉴클레오타이드 위에 균질한 하이브리다이제이션 혼합물을 겹쳐 올리는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저 동기화된 건강한 선충으로부터 RNA를 수집하는 것부터 시작하십시오. 우선, 선충을 세척하여 15 mL 튜브에 재현탁시킨 후 펠릿화합니다. 생성된 선충 펠릿은 0.1 M NaCl 7 mL와 얼음처럼 차가운 60% w/v sucrose 7 mL에 재현탁합니다.

얼음 위에서 15분 동안 배양한 후, 벌레들을 다시 원심분리하여 침전시킵니다. 이제 박테리아가 제거된 벌레들이 위로 떠오르면, 이를 수집하여 RNAse-free water로 세척하고 다시 침전시킵니다. 다시 한번, 깨끗하고 느슨하게 뭉쳐진 침전물을 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 최대 속도로 30초 동안 원심분리합니다.

흡입하여 4 °C에서 10 부피의 RNA later에 보관하며, 다음 단계를 진행할 때까지 유지합니다. 총 RNA 샘플을 준비하려면, 준비된 펠렛을 최대 속도로 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤 펠렛에 분자 분쇄용 레진을 소량 첨가합니다. 그 후 액체 질소를 이용해 혼합물을 동결시키고 유발(pestle)을 사용하여 분쇄합니다.

냉동된 벌레 현탁액을 곱게 갈아 분말로 만들고, 분쇄 후 분말의 저온 상태를 유지하기 위해 필요에 따라 액체 질소를 추가합니다. 추출물을 얼음 위에 5분 동안 둡니다. 5분 후, 추출물을 총 700 µL의 R-L-T-B-M-E 및 472 µL의 100% ethanol과 혼합합니다.

상용 키트를 사용하여 생물학적 샘플당 최종 부피 60 µL의 분리된 RNA를 얻을 수 있습니다. 다음 단계로 넘어가기 전, DNAse I로 처리하여 잠재적인 게놈 DNA 오염을 제거한 후 상용 RNA 정제 키트를 사용하십시오. 최종 부피를 60 µL로 맞추어 키트 절차를 완료하십시오.

마지막으로, 마이크로어레이 하이브리드화 전에 글리옥살 샘플 로딩 염료 처리 및 겔 분석을 통해 RNA 농도를 측정하고 RNA의 무결성을 평가합니다. 일반적인 방법을 사용하여 정제된 RNA를 상보적 DNA로 역전사하며, 시판 키트를 사용하여 분해된 템플릿으로부터 이를 정제한 후 60 µL 부피로 조절합니다. 초음파 처리된 연어 정자 DNA로 마이크로어레이 슬라이드를 블로킹하여 마이크로어레이 하이브리드화를 시작합니다. 한 시간이 지나면 블로킹된 슬라이드를 2회 증류수에 담가 헹군 후 스핀 건조합니다.

Kimwipe로 감싼 50 mL 원뿔형 튜브 안에서 슬라이드를 건조합니다. 이제 2x formamide 기반으로 하이브리다이제이션 완충액을 준비합니다. 먼저, 결정이 완전히 용해되도록 55 °C에서 10분 동안 가온합니다.

그 다음 10,000 gs에서 1분 동안 원심분리합니다. 다음으로 25 µL의 CD NA와 25 µL의 hybridization buffer를 혼합하고, 혼합물을 가볍게 튕겨 섞어줍니다. 이제 혼합물을 빠르게 스핀 다운한 후 80 °C에서 10분 동안 배양합니다.

배양 후, 슬라이드에 닿지 않도록 주의하며 모든 cDNA 샘플을 마이크로어레이 슬라이드 위에 피펫으로 옮깁니다. 샘플이 마이크로어레이 슬라이드 위에 균일하게 퍼지도록 합니다. 주사바늘을 사용하여 커버슬립을 슬라이드 위에 조심스럽게 내립니다. 커버슬립이 완전히 내려가기 전에 다시 들어 올렸다가 바늘로 다시 내리면서 커버슬립이 부드럽게 안착하도록 합니다.

이 기술은 기포 형성을 최소화합니다. 이제 슬라이드를 50 mL 코니칼 튜브에 수평으로 넣고, 슬라이드 아래에 50 µL의 2차 증류수를 넣은 후 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 슬라이드를 세척한 후 짧게 2차 하이브리다이제이션을 수행합니다.

SSC 과정에서 빛에 민감한 캡처 시약과 Antifa 시약이 포함된 두 번째 버퍼를 동일한 기술로 여러 번 적용한 후, 짧은 배양, 추가 세척 및 건조 과정을 거칩니다. 그 후 슬라이드를 스캔할 수 있습니다. 이미지는 오픈 소스 magic tool이 포함된 무료 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다.

Project 탭에서 Build Expression Profile 탭 아래에 새 프로젝트를 생성하고 저장하십시오. Load Image Pair를 선택한 후, red 이미지 파일을 red로, green 이미지 파일을 green으로 선택하십시오. 그 다음 Build Expression Profile 탭을 선택하십시오. Load Gene List를 선택하여 GCAT 웹사이트에서 얻은 C elegance 유전자 목록 파일을 업로드하여 마이크로어레이 이미지를 지정하고 그리드를 설정하십시오.

'build expression profile' 탭을 선택하고 'create edit grid' 옵션을 생성합니다. 이제 그리드를 편집하십시오. 설정 대화 상자에서 그리드 수를 48로, 각 그리드의 행과 열을 각각 22행 22열로 설정하고, 스팟 번호 매기기 방식을 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 선택합니다.

대조도 변경 백분율을 높이고 개별 스폿이 쉽게 구별될 때까지 그리드를 확대합니다. 왼쪽 패널에서 왼쪽 상단 스폿 설정을 선택한 다음, 왼쪽 상단 스폿의 중심을 클릭하고, 이어서 오른쪽 상단 스폿과 첫 번째 그리드의 하단 행을 클릭하여 그리드를 생성합니다. 이 그리드 설정 절차를 48개 그리드 전체에 대해 왼쪽에서 오른쪽으로, 그리고 위에서 아래 방향으로 반복합니다.

그 다음 'file' 탭을 선택하고 'save current grid as'를 클릭하여 저장합니다. 'finished' 탭을 선택하여 분석과 관련 없는 스폿을 제거합니다. 'build expression profile' 탭을 열고 'addressing gridding' 옵션에서 'spot flagging'을 선택합니다.

이제 스트릭 스폿(streak spots)이나 배경 형광을 플래그로 표시하고, 'save current flags'를 선택하여 저장하십시오. 'file' 탭에서 플래그가 표시된 파일들이 세그멘테이션(segmented)되어야 합니다. 마지막으로, 'expression' 탭에서 'explore'를 선택하여 특정 인자에 의해 유도되거나 억제된 유전자를 분석하십시오.

탐색 대화 상자에서 정밀 유전자 일치 기준을 설정하십시오. 발현의 2배 증가 또는 감소 횟수를 설정합니다. 강도를 x라고 하며, X의 값은 발현 변화의 기준이 됩니다.

유도된 유전자의 경우 X보다 큰 최대값을, 억제된 유전자의 경우 X보다 작은 최소값을 입력합니다. 본 실험에서는 염료 교환(dye swap) 대조군 실험을 수행하며, 3단계 및 4단계 유충에서 독립적으로 분리한 두 가지 총 RNA를 녹색 돌연변이 대 적색 야생형, 또는 적색 돌연변이 대 녹색 야생형으로 하이브리드화하여 유전자 발현 변화를 확인합니다. 동일한 절차를 사용하여 세 가지 독립적인 총 RNA 분리를 수행하고, 상용 키트를 이용해 cDNA를 합성하며, 각 cDNA 샘플에 대해 세 가지 하우스키핑 유전자를 대조군으로 하여 실시간 PCR을 3반복으로 수행합니다. 시연을 위해, VSM one에서 유도된 유전자 발현에 대한 다음 결과들을 살펴봅니다.

마이크로어레이 분석을 수행하기 전, 시냅스 강화 특성을 가진 선충 균주인 AK 1468 돌연변이체에서 추출한 RNA의 품질을 겔 전기영동으로 확인합니다. dase one 처리 전후로 두 개의 온전한 리보솜 소단위체가 관찰되는 것은 RNA 샘플의 상태가 양호함을 나타냅니다. 마이크로어레이에서 야생형 cDNA는 빨간색으로, VSM one 돌연변이 cDNA는 초록색으로 표지합니다. 마이크로어레이당 분석된 48개 그리드 중 하나에서, 각 작은 사각형은 프린팅된 단일 올리고뉴클레오타이드를 나타내며, 각 어레이에는 고유한 올리고뉴클레오타이드가 표시되어 있습니다.

4단계 유충에서 분리한 전사체의 마이크로어레이 분석 결과, 주요 정자 단백질(major sperm proteins, MSP)을 코딩하는 유전자들이 VSM one 돌연변이체에서 유도되었으며, 3단계 유충의 마이크로어레이 분석에서도 돌연변이체의 동일한 유전자 가족 내에서 발현 변화가 나타났습니다. 마이크로어레이의 예측 결과를 실시간 PCR 분석으로 검증한 결과, MSP 유전자 가족의 구성원 중 하나인 MSP 32가 VSM one 돌연변이체에서 유도됨을 확인하였습니다. 해당 데이터는 동일한 RNA 수집본을 이용한 실시간 PCR 3회 반복 실험의 평균값을 나타냅니다.

이 영상을 시청한 후에는 과학계에서 사용할 수 있는 수많은 오픈 소스 생물정보학 소프트웨어 프로그램들이 있다는 점을 고려하여, 전장 유전체 분석을 위한 생물정보학 도구를 다루는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.