인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

pre-mRNA 상의 리보핵단백질 결합 부위를 매핑하려면, 우선 관심 있는 prem NNA의 지정된 영역을 30개 뉴클레오타이드 창(window)으로 타일링하여 타일링된 올리고뉴클레오타이드를 어레이 상에 합성하는 것부터 시작하십시오. 어레이에서 올리고뉴클레오타이드를 가열하여 분리한 후, 관심 있는 RNP와 함께 공동 침전시킵니다. 초기 전체 풀은 SCI 3으로 라벨링하고 결합된 풀은 SCI 5로 라벨링하며, 두 풀 모두를 검출 어레이에 적용합니다.

그런 다음 어레이를 스캔하고 특징 추출 소프트웨어를 사용하여 결과를 해석합니다.안녕하세요, 저는 브라운 대학교 MCB 학과의 Will Fairbrother 연구실 소속 Kate Watkins입니다. 오늘은 pre-mRNA 상에서 RNA-단백질 복합체의 정확한 위치를 결정하기 위한 신속하고 저렴한 절차를 보여드리겠습니다. 실험실에서 pre-mRNA를 중첩된 올리고뉴클레오타이드 풀로 재합성합니다.

그런 다음 이 풀(pool)을 공동 면역침전법(co immunoprecipitation)을 통해 결합 분획과 비결합 분획으로 분리한 후 마이크로어레이로 분석할 수 있습니다. 이 절차는 많은 응용 분야가 있지만, 여기서는 여러 스플라이싱 인자와 이들이 선택적 스플라이싱에서 하는 역할을 연구하는 데 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

본 절차를 시작하려면 uc SC genome browser를 사용하여 prem A pool 설계에 필요한 특정 유전자, splice junction 또는 기타 관심 영역을 다운로드하십시오. 관심 윈도우를 선택한 다음, 각 oligo가 이전 oligo에서 10 nucleotide만큼 이동하도록 30 nucleotide의 read length와 20 nucleotide의 overlap을 적용하여 컴퓨터로 타일링하십시오. 30 nucleotide 길이의 oligo가 정의되면, 각각의 양 끝에 universal primer 서열을 부착하십시오.

맞춤형 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 제작을 위해 oligo를 Agilent에 제출하십시오. 마이크로어레이가 도착하면, 어레이 하이브리드챔버에 어레이 커버 슬라이드를 넣고 탈이온수 500 µL를 슬라이드 위에 조심스럽게 피펫팅하여 표면에서 DNA oligo를 회수하기 시작합니다. 각 슬라이드의 라벨이 서로 마주보도록 마이크로어레이 슬라이드를 커버 슬라이드 위에 엎어 놓으며, oligo 회수 과정을 방해할 수 있는 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.

하이브리다이제이션 챔버를 닫고 하이브리다이제이션 오븐에서 99 °C로 하룻밤 동안 회전시키십시오. 다음 날, 챔버에서 어레이를 조심스럽게 꺼내고, 어레이 표면에서 분리된 올리고가 포함된 물을 흡입하여 제거하십시오. 분리된 올리고 풀을 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 넣고, 50% 진폭으로 3~5초씩 3회 초음파 처리하여 응집될 수 있는 덩어리들을 분해하십시오. 그다음, 끝단에 T 프로모터가 부착된 유니버설 프라이머를 사용하여 저사이클 PCR로 해당 풀을 증폭하십시오.

필요한 사이클 수는 올리고 회수 효율에 따라 달라질 수 있습니다. 아크릴아마이드 겔에서 스미어 현상으로 나타나는 과증폭이 발생하지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, Amon사의 mega short script kit를 사용하여 RNA를 전사합니다.

RNA를 페놀-클로로포름으로 추출하여 전사 반응을 종결시킨 후, 아세트산 나트륨과 캐리어로서의 glyco blue를 사용하여 에탄올 침전을 수행합니다. RNA 펠렛을 105 µL의 TE 버퍼에 다시 현탁합니다. 이는 RNA 농도를 정확하게 측정하기 위함입니다.

RiboGreen을 사용하여 표준 곡선을 생성하십시오. 그런 다음 형광 플레이트 리더를 사용하여 측정하십시오. 이제 RNA 풀이 준비되어 공동 면역침전(co-immunoprecipitation)을 통한 풀다운(pull down)을 시작할 수 있습니다.

먼저, 단백질 A와 단백질 G dyna beads를 1:1 비율로 혼합하여 반응당 최종 부피가 50 µL가 되도록 하여 자성 비드를 준비합니다. 자성 분리 스탠드를 사용하여 비드를 한곳에 모은 뒤 상층액을 제거합니다. 그런 다음 차가운 1x PBS를 동일한 부피로 사용하여 두 번 세척합니다.

비드를 동일한 부피의 차가운 1X PBS에 현탁하고, 비드당 2ng의 항체를 첨가합니다. 이 양은 항체에 따라 다를 수 있으므로, 항체를 비드에 결합시키기 위한 최적의 조건을 찾기 위해 실험이 필요할 수 있습니다. 혼합물을 회전 플랫폼 위에서 4°C로 하룻밤 동안 인큐베이션합니다.

오전에, 비특이적 결합을 차단하기 위해 반응당 2 µg의 초음파 처리된 효모 총 RNA를 첨가하고 4 °C에서 30분 동안 추가로 회전시킨다. 차단 단계가 완료되면, 다시 자석 랙을 사용하여 상층액을 제거한다. 그런 다음 차가운 1X PBS로 비드를 두 번 세척하고, 두 번째 세척 후의 PBS를 튜브에 남겨둔 채 비드 혼합물 50 µL씩을 새 튜브에 분주한다.

각 co IP 반응당 튜브 하나를 준비합니다. 이제 비즈가 co ip 준비되었습니다. 다음으로, RNA 올리고 풀(oligo pool)과 핵 세포 추출물을 혼합하여 마스터 믹스를 준비합니다.

RNP 소스로서, 마스터 믹스 50 µL 분취액을 전체 샘플 보호 프라이머로 취합니다. 유니버설 프라이머의 RNA 버전인 보호 프라이머는 단백질이 프라이머 서열에 결합하는 것을 방지하거나 RNA에 이차 구조가 도입되는 것을 막기 위해 추가할 수 있습니다. 공동 면역침전(co immunoprecipitation)을 시작하려면, 비드 분취액에서 상층액을 제거하고 남은 마스터 믹스 120 µL에 비드를 재현탁합니다. 반응물을 4 °C에서 1~2시간 동안 흔들어 섞어줍니다.

배양 종료 후, 각 공동 침전물(co ip)에서 비드를 포함한 소량의 Eloqua를 제거할 수 있습니다. 결합 효율이나 특이성을 추가로 테스트하려면, 나머지 반응물을 자석 위에 놓아 상층액을 제거하십시오. 그 후 차가운 one XPDS로 1~2회 세척하십시오.

RNP를 통해 비드 상의 항체에 결합된 RNA가 바로 IP 샘플입니다. IP 비드를 0.1 XTE 버퍼 내 1% SDS 50 µL에 재부유시키고, 샘플을 65 °C에서 15분 동안 가열하십시오. RNA를 용출하기 위해 상층액을 제거하는데, 이 상층액에는 이전에 비드에 결합되어 있던 RNA가 포함되어 있습니다. 페놀 클로로포름 추출 후 에탄올 침전법으로 정제하고, 펠릿을 0.1 XT 버퍼 50 µL에 재부유시키십시오.

다음으로, 범용 역전사 프라이머(reverse universal primers)를 사용하여 샘플을 역전사합니다. 그 다음, 범용 프라이머(universal primers)를 사용하여 샘플을 PCR 증폭시키며, 이 중 하나의 프라이머는 T7 프로모터를 포함해야 합니다. 풀(pool)을 증폭하는 데 필요한 사이클 수는 co-IP의 효율성에 따라 달라집니다.

Ambion의 mega shorts script kit를 사용하여 샘플을 다시 전사하되, 이번에는 키트에 포함된 T7 UTP 대신 2 µL의 amino allyl UTP를 첨가하십시오. amino allyl UTP는 나중에 RNA를 Cy-dye로 표지하는 데 사용됩니다. 전사가 완료되면.

페닐 클로로폼 추출물과 에탄올로 시료를 침전시킵니다. 어레이에 대한 시료의 하이브리다이제이션을 방해할 수 있는 glyco blue 또는 아세트산 암모늄은 사용하지 마십시오. 침전물을 4.5 µL의 0.1 M 탄산나트륨에 재현탁합니다.

먼저 샘플에 라벨을 지정하려면, 전체 샘플에 nuclease free water 2.5 µL를 추가하십시오. S3 3 µL를 추가하고 IP 샘플에는 SCI five 3 µL를 추가하십시오. 암소에서 1시간 동안 배양하십시오.

실온에서 각 샘플에 4 M hydroxyl lamine HCL 6 µL를 첨가하여 반응을 종결시키고, 충분히 혼합한 후 원심분리합니다. 실온에서 15분 동안 짧게 배양한 후, 페닐 클로로포름 추출과 에탄올 침전을 통해 표지된 샘플을 정제합니다. 색상의 대부분은 유리 뉴클레오타이드와 함께 유기상으로 제거되므로, 펠렛에 색이 보이지 않을 수 있습니다.

각 펠렛을 50 µL의 0.1 XTE에 다시 현탁합니다. 다음의 예외 사항을 제외하고, Agilent 어레이 하이브리다이제이션 키트 지침에 따라 마이크로어레이 샘플을 준비하십시오. RNA를 단편화하지 마십시오. 단편화 버퍼를 추가한 직후에 하이브리다이제이션 버퍼를 추가하여 단편화를 중단시킵니다.

샘플을 어레이에 올리고, 어레이를 회전시키면서 50 °C에서 3시간 동안 하이브리드화합니다. 50 mL 원추형 튜브에 다음과 같이 50 mL 용액들을 준비합니다. 2배 농도 SC 버퍼 1튜브, 1배 농도 SC 버퍼 2튜브, 그리고 탈이온수 1튜브를 준비합니다.

3시간의 배양 후, 어레이 슬라이드 샌드위치의 클램프를 조심스럽게 풀고 2 XSSC 버퍼에 넣습니다. 핀셋을 사용하여 커버 슬라이드로부터 어레이를 부드럽게 분리합니다.

어레이에 닿지 않도록 주의하며 커버 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다. 슬라이드를 꺼내면서 원추형 튜브의 뚜껑을 닫고 60초 동안 부드럽게 뒤집어 섞어줍니다. 핀셋을 사용하여 어레이를 1X SSC 용액으로 옮깁니다.

튜브의 캡을 닫고 1분 동안 부드럽게 반전 혼합합니다. 그다음 어레이를 두 번째 XSSC 용액으로 옮겨 다시 1분 동안 부드럽게 반전 혼합합니다. 마지막으로, 어레이를 탈이온수가 담긴 튜브로 옮겨 30초 동안 부드럽게 반전 혼합합니다.

슬라이드의 가장자리를 킴와이프(kim wipe) 위에 올려 어레이를 건조시킵니다. 올리고뉴클레오타이드(oligos)가 포함된 면이 손상되지 않도록 주의하며 와이프 위에서 어레이를 계속 회전시킵니다. 어레이를 빈 원추형 튜브(conical tube)에 넣고 어레이 스캔을 진행합니다.

어레이 스캔을 진행합니다. 여기 대표적인 어레이가 있습니다. 각 피처 또는 올리고는 전체 비농축 풀의 경우 녹색으로, IP 농축 풀의 경우 빨간색으로 표시됩니다.

각 특징점의 신호는 해당 채널의 전체 강도에 대해 정규화됩니다. 최종 출력값은 녹색 채널에 대한 적색 채널의 로그 비(log ratio)입니다. 어레이의 각 특징점에서, 각 게놈 좌표의 평균 점수가 해당 위치에 매핑됩니다.

점수가 2, 4, 0.5인 세 개의 중첩된 30 nucleotide oligo에 대한 이 평균화 단계의 예시가 제시되어 있으며, 각 10 nucleotide window에 대한 평균 농축 점수가 표시되어 있습니다. 여기 CLTA 유전자에서 poly pyrimidine track binding protein PTB의 결합 체계 예시가 있으며, 유전자 특징은 하단에 표시되어 있고 PTP 결합 부위의 로그 평균 농축 점수는 진한 빨간색 수직 막대로 나타나 있습니다. 연한 빨간색 막대는 PTP 결합이 농축되지 않은 영역을 나타냅니다.

지금까지 선택적 스플라이싱이 일어나는 액손과 같은 관심 영역 전체를 타일링하는 올리고뉴클레오타이드 풀을 빠르고 효율적으로 생성하는 방법을 보여드렸습니다. 저희는 마이크로어레이로 풀을 분석하지만, Illumina, Lexi 시퀀싱 또는 보다 전통적인 Sanger 시퀀싱을 통해 시퀀싱하는 것도 가능합니다. 이 절차를 수행할 때, 풀의 생성 과정이 RNA 또는 단백질 수준에서 수정 가능하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

RNA 수준에서는 올리고뉴클레오타이드 서열에 자가 영역, 질병 돌연변이, 다형성 또는 무작위 돌연변이를 도입할 수 있습니다. 단백질 수준에서는 인산화 또는 기타 번역 후 수정을 통해 RNA 결합 인자를 변형할 수 있습니다. 또한, 관심 대상인 RNA 결합 단백질과 경쟁하거나 상호작용하는 추가 인자의 수준을 증가 또는 감소시키도록 결합 환경을 조절할 수 있습니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.