RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

본 영상의 목적은 면역침전법을 이용하여 세포 추출물로부터 리보핵산단백질 복합체의 RNA 및 단백질 구성 성분을 분리하고 식별하는 방법을 시연하는 것입니다. 안녕하세요, 저는 미주리 대학교 분자 미생물 및 면역학과의 대학원생이며 Eli sso 박사님 지도하에 공부하고 있는 Garrett Dom입니다. 고처리량 시퀀싱과 효율적인 마이크로어레이 분석의 발전으로 인해, 전역적 유전자 발현 및 분석은 많은 연구 및 질병 모델에서 쉽고 간편하게 이용 가능한 데이터 수집 형태가 되었습니다.

하지만 표적 유전자 mRNA의 정상 상태 수준이 항상 단백질의 정상 상태 수준과 직접적으로 상관관계를 갖는 것은 아닙니다. 두 수치 간의 이러한 차이는 전사 후 유전자 조절로 설명될 가능성이 높으며, 이는 RNA 결합 단백질의 상호작용에 의해 유도됩니다.

전사 후 조절은 표적 mRNA와 리보핵단백질 복합체를 형성함으로써 mRNA의 국소화, 안정성 및 번역에 영향을 미칩니다. 세포 추출물 내의 이러한 복합체로부터 알려지지 않은 de novo mRNA 표적을 식별하는 것은 RNA 결합 단백질의 메커니즘과 기능을 이해하고, 그로 인한 단백질 생성 효과를 파악하는 데 매우 중요합니다. 본 프로토콜에서는 리보핵단백질 복합체에 결합된 특정 mRNA를 식별할 수 있는 리보단백질 면역침강법(ribonucleoprotein immunoprecipitation, RIP)이라 불리는 방법을 설명합니다.

실험을 시작하기 전에 모든 시약, 용기 및 도구를 준비하는 것이 중요합니다. 유리 기구는 Ambion사의 RNA ZAP와 같은 RNase 억제제로 처리한 후 DEPC 처리된 물로 헹궈 RNase-free 상태로 만들고, 모든 시약이 RNase-free임을 확인하십시오. 절차의 첫 번째 단계는 세포 용해물에서 리보핵단백질 복합체를 회수하는 것입니다. 사용되는 각 샘플당 2~5mg의 총 단백질을 생산할 수 있도록 지수 성장기의 조직 세포를 회수하며, 일반적으로 100mm 배양 접시 2개면 충분합니다.

본 실험에서는 MB 231 및 MC seven 인간 유방암 세포주를 수확하여 RNA 결합 단백질의 리보핵산 상호작용을 조사합니다. 조사 대상인 각 RNA 결합 단백질에 대해, 적절한 표적 mRNA와 RNA 결합 단백질 간의 상호작용을 최대화하려면 총 세포 수와 단백질 양을 최적화해야 한다는 점에 유의하십시오. 4°C에서 약 8~10분 동안 1000 RPM으로 원심분리하여 세포를 펠렛화한 후, 차가운 PBS로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 튜브 바닥을 가볍게 쳐서 세포 펠렛을 RNase 및 프로테아제 억제제가 포함된 조제된 폴리솜 용해 버퍼와 동일한 부피로 재현탁합니다.

세포 펠릿의 정확한 부피를 측정하고, 파이펫으로 혼합물을 부드럽게 파이펫팅하여 세포 덩어리를 분해한 뒤, 용해물을 얼음 위에서 5분 동안 배양하는 것이 권장됩니다. 4°C에서 13,000 G로 20분 동안 원심 분리하여 용해물에서 부유물을 제거하십시오. 정제된 상층액을 즉시 미리 냉각된 RNase-free 마이크로 원심 분리 튜브로 옮겨 얼음 위에 보관하고, -80°C에서 저장하십시오.

이 용해물은 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 단백질 또는 mRNA의 분해를 초래할 수 있으므로 반복적인 동결-해동 주기를 피하십시오. IP는 즉시 수행하는 것이 가장 좋습니다.

표준 Bradford 단백질 분석법을 사용하여 라이세이트 내 단백질 농도를 빠르게 정량합니다. 다음으로, 목표로 하는 특정 단백질을 분리하기 위한 재료를 준비해야 합니다. 먼저 단백질을 사전 팽윤시킵니다.

5% BSA가 첨가된 NT two buffer에 Sphero 비즈를 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. NT two buffer를 PAS 비즈와 4:1 비율로 사용하십시오. 4°C에서 최대 수개월 동안 장기 보관이 가능합니다.

사용 전 0.1% sodium azi를 첨가한 경우, 최종 비드 대 완충액 비율이 1:1이 되도록 과량의 NT two buffer를 제거합니다. 1.5 milliliter RNA free micro centrifuge tube를 사용하여, 각 IP 반응당 100 microliters의 SRO speed slurry를 취하고 30 micrograms의 항체를 첨가합니다. 예를 들어, 본 실험에서는 mouse IgG one 항체인 who are antibody를 사용합니다.

따라서 대조군 항체 또한 IgG를 사용합니다. 다음으로, 항체 비드 혼합물에 NT two 버퍼 100~200 µL를 첨가합니다. 또한, 백그라운드 RNA에 대한 항체 대조군으로 동일 종의 아이소타입 일치 항체 또는 정상 혈청 전체를 병행하여 사용해야 합니다.

적절한 항체를 비드 혼합물에 첨가하고 4°C에서 오버엔드 텀블러로 하룻밤 동안 배양합니다. 사용 직전에 1mL의 얼음처럼 차가운 NT 2 버퍼로 5회 세척하여 항체 코팅 비드를 준비합니다. 4°C에서 13,000 G로 1~2분간 원심분리하여 비드를 세척합니다. 핸드 피펫터 또는 흡입기로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

이 세척 단계는 항체 혼합물로부터 결합되지 않은 항체와 RNA 오염 물질을 제거하는 데 도움이 됩니다. 마지막 세척이 완료되면, 비즈를 700 µL의 차가운 NT2 버퍼로 재현탁하고, 표적 mRNA를 보호하기 위해 10 µL의 RNase 억제제, 10 µL의 100 mM DTT 및 15 µL의 EDTA를 포함한 다양한 RNA 억제제를 처리합니다. NT2 버퍼를 사용하여 최종 부피를 900 µL로 맞춥니다.

다음으로, 표적 복합체를 면역 침전시킵니다. RIP 절차 후 RNA 분석 시 배경 신호를 줄이기 위해 프리클리어(pre-clear) 단계를 수행할 것을 강력히 권장합니다. 4°C에서 30분 동안 15 µg의 아이소타이프 대조군(isotype control)으로 프리클리어를 수행하십시오. 항체가 코팅되지 않은 50 µL의 사전 팽창된 PAS 비드를 추가합니다.

4°C에서 30분 동안 회전시키며 배양한 후, 4°C에서 10,000 G로 원심분리합니다. 펠릿을 형성합니다. 면역침강법(ip)을 위해 상층액을 보관합니다.

다음으로, 약 2~5 mg의 단백질이 포함된 분리된 투명 용해물 100 µL를 준비된 항체 혼합물에 첨가합니다. 용해물을 희석하면 배경 신호를 줄이는 데 도움이 됩니다. 튜브를 랩으로 감싸고 파라필름으로 밀봉하여 4 °C에서 4시간 동안 회전시키며 배양합니다. 이후 4 °C에서 5,000 ×g로 5분 동안 원심분리하여 비드를 펠렛화하고, 상층액은 앞서 설명한 대로 -80 °C에 보관하여 추후 분석에 사용합니다. 비드를 1 mL의 ice-cold TNT buffer로 5회 세척하고 원심분리합니다.

그 다음 핸드 피펫터나 흡입기(aspirator)를 사용하여 상층액을 제거합니다. NT2 버퍼에 sodium deoxy coate, urea 또는 SDS를 첨가하여 배경 신호를 줄이기 위한 더 엄격한 방법을 사용할 수 있습니다. 표적 mRNA의 분해를 최소화하기 위해 샘플을 가능한 한 얼음 위에 보관하고 신속하게 작업하십시오.

마지막으로, DNAse 및 proteinase K 처리 후 RNA 침전법을 사용하여 리보핵산단백질(ribonucleoprotein) RNA를 분리합니다. 세척 후, 5 µL의 RNAse-free DNAse I이 첨가된 100 µL의 N NT2 버퍼로 비드를 재부유시킵니다. 샘플을 37 °C에서 5~10분 동안 유지합니다. N NT2 버퍼 1 mL를 추가하고 5,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 버리고 SROs 펠릿을 10 mg/mL의 proteinase K 5 µL와 10% SDS 1 µL가 포함된 NT2 버퍼 100 µL로 재부유시킵니다. 재부유된 비드 혼합물을 55 °C 항온수조에서 30분 동안 배양하며, 10분마다 가볍게 튕겨 섞어줍니다. Proteinase K는 리보핵단백질 성분의 방출을 돕습니다. 비드를 펠릿화합니다.

실온에서 5,000 G로 5분 동안 원심분리하고, 부피가 약 100 µL인 상층액을 수집합니다. 다음으로 비드에 NT 2 버퍼 200 µL를 첨가하고 5,000 G에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액 약 200 µL를 수집하고 비드는 폐기합니다.

상층액을 합친 후 하층 산성 페놀 300 µL를 첨가하고 볼텍싱합니다. 실온에서 1분간 처리한 후, 실온에서 최대 속도로 1분간 원심분리합니다. 상층액 250 µL를 수집합니다.

인터페이스가 흐트러지면 오염될 수 있으므로 매우 주의하십시오. RNA 샘플에 pH 5.2의 sodium acetate 25 µL, 냉각된 100% ethanol 625 µL, glyco blue mix 5 µL를 추가합니다. 잘 섞은 후 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.

또한, RNA를 적절하게 회수하기 위해 GlycoBlue를 첨가합니다. GlycoBlue는 운반체 분자로 작용하여 다음 날 RNA 펠렛의 가시성을 높여줍니다. 튜브를 3~5회 반전시켜 혼합한 후, 4°C에서 12,000 G로 30분간 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 냉각된 70% ethanol 1 mL를 푸른색 펠렛에 첨가하고, 반전 혼합 또는 볼텍싱 후 원심분리합니다.

4°C에서 12,000 G로 2분간 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 4°C에서 12,000 G로 1분간 다시 원심분리합니다. 피펫으로 남아있는 70% ethanol을 모두 제거하고 펠렛을 공기 건조시킵니다.

실온에서 5분 동안 방치합니다. 20~40 µL의 RNA 및 DNA free water로 다시 현탁합니다. 이제 샘플은 NanoDrop 분광법을 통한 정량 분석과, RNA 분리 후 quantitative real-time PCR 또는 microarray 분석과 같은 추가적인 하위 응용 분석을 수행할 준비가 되었습니다. RNA 결합 단백질인 whoare의 mRNA 표적과 면역침강법을 통한 결과적인 농축도를 밝히기 위해 microarray 및 quantitative real-time PCR을 수행하였습니다.

웨스턴 블롯(western blot)을 통한 확인 결과, 단백질이 깨끗하게 분리되었음을 알 수 있습니다. 정량적 PCR(Quantitative PCR)은 IgG 컨트롤과 비교하여 표적 mRNA인 beta actin의 배수 농축도를 보여줍니다. 마이크로어레이 분석 결과 MC seven과 MB 2 31 유방암 세포주 사이에 고유한 유전적 프로파일이 나타났으며, 전반적으로 리보핵단백질 면역침강법(rib nucleo protein immunoprecipitation)은 본 연구진뿐만 아니라 많은 다른 연구 그룹에서 RNA 결합 단백질과 그 표적 mRNA 사이의 상호작용을 분리하고 연구하는 데 사용되는 우수한 도구로 확립되었습니다. 이 절차는 특성상 세심한 주의와 숙련도가 필요하지만, 적절하게 수행한다면 최근까지 발견 및 분석이 어려웠던 이러한 리보핵단백질 복합체를 분리해 낼 수 있습니다.