Microfluidic Perifusion 장치 내에서 멀티 파라메 트릭 아일릿 Perifusion 시스템

본 발표에서는 인슐린 분비 촉진제에 반응하는 췌장 섬의 동적 인슐린 분비, 칼슘 유입 및 미토콘드리아 전위 변화를 동시에 측정하기 위한 미세유체 기반의 췌장 섬 관류 시스템을 소개하겠습니다. 이 관류 시스템은 3층 구조의 미세유체 장치, 시린지 펌프 및 분획 수집기로 구성됩니다. 인슐린 분비 촉진제로 유도된 칼슘 유입과 미토콘드리아 전위는 형광 현미경 설정을 통해 이미징됩니다.

안녕하세요, 저는 일리노이 대학교 시카고 캠퍼스 이식외과 Val Holter 교수님 연구실의 Waller인 Ola입니다. 안녕하세요, 저도 Holter 교수님 연구실의 Don Lee입니다. 안녕하세요, 저 역시 Holter 교수님 연구실의 Tricia Hart입니다.

오늘은 선형 포도당 농도 구배를 이용한 안검 동시 이미징 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 안검의 시각적 특성과 기능을 연구하기 위해 이 절차를 사용했습니다. 그럼 시작하겠습니다.

이 절차에 사용된 미세유체 장치는 표준 포토리소그래피로 제작된 세 층의 경화된 PDMS로 조립되었습니다. 실리콘 마스터로 제작된 첫 번째 층에는 아이렛을 부드럽게 고정하는 미세유체 장치의 웰이 있으며, 깊이는 150 micrometers, 직경은 500 micrometers입니다. 두 번째 층에는 높이 500 micrometers, 너비 2 millimeters의 채널이 있습니다.

솔루션의 교환 효율을 높이기 위해 채널 중앙부를 확장하여 흐름을 분산시켰습니다. 장치 내부의 교환 웰(exchange well)은 레이어 중앙에 높이 3 mm, 너비 7 mm의 구멍을 뚫어 제작합니다. 세 번째 레이어는 두꺼운 PDMS 슬랩입니다. 이 레이어를 준비하기 위해 채널의 입구 및 출구와 일치하도록 양쪽에 작은 구멍을 뚫습니다.

세 개의 층이 모두 제작되면, 두 번째 층의 경우, 먼저 첫 번째 층을 웰(well)이 위를 향하도록 하여 유리 슬라이드에 접합합니다. 그런 다음 채널 간격이 위로 오도록 하여 두 번째 층을 첫 번째 층에 접합합니다. 마지막으로, 세 번째 층을 두 번째 층에 접합합니다.

층들이 접합되면 장치를 실험에 사용할 준비가 된 것입니다. 70% ethanol을 채우고 Tygon 튜빙을 통해 장치의 입구 포트에 연결한 10 milliliter 주사기를 사용하여, 에탄올을 장치의 채널로 흘려보내 미세유체 장치를 멸균합니다. 그런 다음 동일한 설정을 사용하여 탈이온수를 흘려보내 에탄올을 세척합니다.

장치를 멸균한 후, 타이곤 튜빙을 사용하여 가열된 현미경 스테이지 위에 배치하고, 고농도 및 저농도 포도당 용액이 담긴 시린지 펌프를 Y형 커넥터에 연결하십시오. 그런 다음 미세유체 장치의 입구에 연결하십시오. 미세유체 장치의 출구는 분획 수집기에 연결하십시오.

튜빙이 37 °C 핫플레이트 위에 놓여 있는지 확인하십시오. 실험 전반에 걸쳐 용액을 생리적 온도로 유지하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, LabVIEW 프로그램을 사용하여 실험 동안 미세 유체 네트워크를 통해 주입될 포도당 농도 구배를 설정하십시오.

이 소프트웨어는 두 가지 포도당 용액의 유량을 조절합니다. 시린지 펌프를 제어함으로써 선형, 종 모양 및 사각형 모양의 다양한 포도당 구배 프로파일을 생성할 수 있습니다. 본 실험에서는 계산된 예상 값과 비교하여 표시하며, 두 포도당 용액의 유량을 0.01 mL/min씩 가변적으로 조절하고 용액이 혼합된 후 장치로 유입되는 유량을 0.25 mL/min으로 일정하게 유지하여 2 mM에서 25 mM까지의 선형 포도당 구배를 사용할 것입니다.

적절한 기울기 프로파일을 선택한 후, 해당 기울기의 안정성을 테스트하십시오. 먼저 기울기 시스템을 가동합니다. 그런 다음 분획 수집기를 시작하여 1 mL EPR 튜브에 여덟 개의 분획을 수집하십시오.

그런 다음 혈당측정기를 사용하여 각 튜브의 포도당 농도를 측정하고 엑셀에 기록하십시오. 혈당측정기로 얻은 결과를 분석하십시오. 다음으로, 고농도 포도당 주사기를 Krebs ringer buffer 내의 0.5%BSA 용액이 담긴 주사기로 교체하고, 분당 1 mL의 속도로 장치에 50 mL를 관류하십시오.

이는 BSA로 관류한 후 분비된 인슐린 수치를 측정할 때의 정확성을 보장하기 위해 마이크로채널 벽에 인슐린이 비특이적으로 흡착되는 것을 방지하기 위함입니다. 이를 고농도 포도당 용액으로 교체하십시오. 엄선된 25~30개의 마우스 안구 조각(eyelets)을 칼슘 지시약 fira 2:00 AM과 미토콘드리아 막전위 지시약 rumine 1 2 3이 포함된 2 mM 포도당 Krebs ringer 완충액에 현탁하고, 37 °C에서 30분 동안 배양하십시오.

배양 후, 기기를 관류 시스템에서 분리하고, islet이 담긴 피펫 팁을 유입구 포트에 삽입하여 islet을 미세유체 소자 내로 조심스럽게 로딩합니다. 로딩 후 기기를 관류 시스템에 다시 연결하며, 이때 기포가 유입되지 않도록 주의합니다. 다음으로, 시린지 펌프를 작동시켜 2mM glucose가 함유된 KRB로 islet을 관류하기 시작합니다.

이 단계에서는 배지에서 과잉 염료를 세척하고, 실험 중에 사용할 여기 및 방출 필터 세트와 노출 시간을 지정합니다. 그다음, 저포도당 용액이 들어있는 안구(eyelets)를 처리하는 동안 분획 수집기가 1분 간격으로 수집하도록 설정하십시오. simple PCI 이미징 소프트웨어의 관심 영역(ROI) 도구를 사용하여 이미징하려는 영역 또는 안구를 정의하십시오.

또한, 세포를 10분 동안 세척한 후 감산할 배경 영역을 지정하고, 포도당 농도 구배 분획 수집기를 가동하며 타임랩스 이미징을 시작하십시오. 30분 후, 소프트웨어와 고농도 포도당 시린지 펌프를 끕니다. 고농도 포도당의 영향을 제거하기 위해 저농도 포도당으로 계속 관류하십시오.

10분 후, 시린지 펌프를 꺼서 저농도 포도당의 흐름을 중단합니다. 관류 후, 분석을 위해 데이터를 Excel로 내보냅니다. 관류액으로 분비된 인슐린 양은 mouse islet ELISA로 측정할 수 있습니다.

여기에 표시된 것과 같이 2에서 25 mM의 선형 농도 구배의 포도당으로 관류시켰습니다. 6 mM 포도당에 해당하는 관류 후 약 13분이 지나면 칼슘 유입과 인슐린 분비가 유발됩니다. 예상대로 미토콘드리아 전위의 변화는 그보다 앞선 약 11분경에 관찰됩니다.

이 데이터는 아이렛(eyelet) 생리학적 특성을 분석하는 데 있어 이 미세유체 네트워크를 사용하는 것의 이점을 보여줍니다. 지금까지 아이렛 생리학 연구를 위해 미세유체 파라 퓨전(para fusion) 장치를 사용하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 장치 내에 기포가 없도록 확인하는 것이 중요합니다. 기포가 있을 경우 실험 중에 아이렛이 이동할 수 있기 때문입니다.

또한, 아일렛(eyelets)을 건드리지 않고 분당 최대 1ml까지 유량을 조절할 수 있습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.