Microfluidic 네트워크 및 표준 재관류 회의소를 사용하여 뇌 슬라이스 자극

오늘 저희가 보여드릴 프로젝트의 주요 목적은 뇌 자극을 공간적 및 시간적으로 제어할 수 있게 하는 것입니다. 또 다른 주요 포인트는, 이미 복잡한 전기생리학적 설정에 간단한 수정을 가함으로써, 실제로 이러한 뇌 자극을 사용하는 다양한 연구실에 이 미세유체 장치를 보급할 수 있다는 점입니다. 안녕하세요, 저는 일리노이 대학교 시카고 캠퍼스 생체공학과 에딩턴 연구실의 자바 첵 모하마드입니다.

오늘은 뇌 절편 자극을 위해 간단한 미세 가공 마이크로플루이딕 장치를 적용하는 방법을 보여드리겠습니다. 오늘 시연할 뇌 절편 장치는 여러 가지 이유로 매우 유용한데, 가장 주된 이유는 모듈식 구조로 되어 있어 추가적인 수정 없이도 기존의 전기생리학적 설정에 바로 적용할 수 있기 때문입니다. 또한, 마이크로플루이딕 장치를 복잡하게 만드는 튜브와 펌프의 사용을 배제하였습니다.

수동 펌핑 방법을 사용하므로 튜빙이나 펌프가 필요하지 않습니다. 세 번째는 이것이 단지 얇은 PDMS 막 시트로 되어 있어, 표준 전기생리학 설정에 사용되는 표준 관류 챔버와 커버슬립 사이에 삽입된다는 점입니다. 오늘 제가 시연할 절차는 표준 SU-8 리소그래피 공정으로 제작된 SU-8 마스터에서 시작됩니다.

오늘 사용할 마스터는 2단계 마스터로, 한 단계에는 마이크로 채널의 설계가 포함되어 있고, 다른 단계에는 채널 상단에 위치한 비아(via) 개구부 설계가 포함되어 있어 채널을 통해 흐르는 용액이 비아 개구부를 통해 나올 수 있습니다. 실리콘 웨이퍼 상에 이 마스터를 제작한 후, 실리콘 또는 PDMS를 이 장치 위에 부어 웨이퍼 상의 구조가 PDMS에 성형되도록 합니다. 이제 이 장치 위에 PDMS를 부어보겠습니다.

그 다음, 경화 후 형성되어 커버슬립에 접합된 PDMS 막을 준비합니다. 이렇게 하면 미세유체 장치가 완성됩니다. 이어서, 관류 챔버 바닥에 얇은 PDMS 층을 코팅하여 표준 관류 챔버를 수정하겠습니다.

이렇게 수정된 관류 챔버가 준비되면, 이전에 제작한 미세유체 장치를 가져와 관류 챔버에 접합합니다. 미세유체 장치 제작 시 두 가지 중요한 주의 사항이 있습니다. 첫 번째는 PDMS를 올리기 전에 핫플레이트를 꺼야 한다는 점이며, 이는 PDMS를 웨이퍼 위에 부을 때 즉시 경화되는 것을 방지하기 위함입니다.

또한 중요한 점은 실리콘 웨이퍼의 네 모서리에 사용하는 스페이서의 높이가 실리콘 웨이퍼 상의 가장 높은 구조물보다 낮아야 한다는 것입니다. 이는 PDMS 경화 과정을 진행할 때 VR 개구부를 확실히 확보하기 위함입니다. 현재 저희는 소프트월 모듈형 클린룸에 있으며, 이것이 표준 C8 리소그래피 공정을 사용하여 제작한 마스터입니다.

그리고 이는 2층 구조의 마스터로, 첫 번째 층에는 4개의 입구와 1개의 출구를 가진 채널 설계가 포함되어 있습니다. 4개 채널 모두의 중앙 영역에는 채널 위에 솟아 있는 비아(via) 또는 포스트(post)가 있습니다. 이것들은 제작 과정 중에 생성된 정렬 마크입니다.

이제 정렬 마크를 제거하고 PDMS 경화를 진행하는 방법을 보여드리겠습니다. 엣지 비드 효과(edge bead effect)로 인해 웨이퍼 외곽의 두께가 중앙에 위치한 실제 소자보다 더 두껍습니다. 따라서 면도날을 사용하여 이 정렬 마크를 제거한 다음, 웨이퍼의 무게를 지탱하기 위해 높이가 140 micron인 스페이서를 웨이퍼의 네 모서리에 배치하겠습니다.

따라서 면도날이 실제 소자 근처에 닿지 않도록 주의해야 합니다. 이제 에어 더스터를 사용하여 이 SVA 입자들을 제거하겠습니다. 이제 웨이퍼는 PDMS 몰드 준비가 완료되었습니다. 하지만 그 전에, 140 µm 높이의 스페이서를 배치해야 합니다.

이제 웨이퍼의 네 모서리에 네 개의 테이프를 부착하겠습니다. 그런 다음 테이프가 웨이퍼에 제대로 접착되었는지 확인하겠습니다. 테이프의 높이를 140 micron으로 설정한 이유는 채널과 VS가 있는 2단 마스터의 높이가 150 micron이기 때문입니다.

PDMS 경화 과정 중 PDMS 위에 무게추를 놓을 때, PDMS 시트가 평평하게 나오도록 해야 합니다. 따라서 모서리 네 곳에 동일한 높이의 스페이서 4개를 사용합니다. 이제 장치를 제작하기 위해 PDMS를 어떻게 코팅하고 경화하는지 보여드리겠습니다.

하지만 그 전에, PDMS 용액을 어떻게 준비했는지 보여드리겠습니다. 먼저 베이스 10부분과 경화제 1부분을 취하여 충분히 혼합합니다. 혼합 과정에서 PDMS 용액 내에 많은 기포가 생성되는 것을 볼 수 있는데, 이 기포들을 제거하기 위해 PDMS를 데시케이터에 넣습니다. PDMS를 데시케이터에 10분 동안 둔 후에는 기포가 모두 사라집니다.

이제 PDMS가 경화될 준비가 되었습니다. PDMS를 웨이퍼 위에 도포하고 경화시켜 PDMS 멤브레인을 얻는 방법을 보여드리겠습니다. 웨이퍼 위에 PDMS를 도포한 다음, 이 투명 필름을 사용하여 PDMS를 덮겠습니다.

이렇게 하면 장치 지지대를 제거하여 장치를 투명 필름에서 분리할 수 있으며, 그 후 투명 필름 위에 무게추를 올려놓겠습니다. 무게추를 사용하는 이유는 PDMS의 두께를 균일하게 만들기 위해서입니다. 또 다른 중요한 문제는 비아(via) 개구부를 확보하는 것입니다.

따라서 vs가 있는 곳에는 PDMS가 없어야 하며, 추를 사용해 이를 구현할 수 있습니다. 보시는 바와 같이 핫플레이트의 전원이 꺼져 있는데, 이는 PDMS가 즉시 경화되는 것을 방지하기 위함입니다. 그 후, PDMS를 붓기 전에 웨이퍼가 평평한지 확인해야 합니다.

이제 앞서 준비한 PDMS를 옮겨 담을 수 있습니다. 기포가 생기지 않도록 PDMS를 웨이퍼에 충분히 가까이 대고 분주하십시오. 여기서 가장 중요한 점은 PDMS 위에 투명 필름을 덮는 방법입니다.

시트를 배치할 때 기포가 발생하지 않도록 주의해야 합니다. 이제 유리 슬라이드 하나를 배치하여 과잉 PDMS가 빠져나가게 하겠습니다. 이 특정 마스터의 경우 유리 슬라이드가 움직이지 않도록 세 개의 유리 슬라이드를 더 배치하겠습니다.

이러한 특정 기능들의 경우, 4개의 유리 슬랩을 배치하여 투명층과 웨이퍼 사이에서 과잉 PDMS가 빠져나올 수 있도록 하는 것이 효과적임을 확인했습니다. 1~2분 정도 대기한 후 핫플레이트를 가동할 수 있습니다. 마스터나 설계 디자인에 따라 비아 개구부(via openings)를 확보하기 위해 유리 슬랩의 수를 늘리거나 줄여야 할 수도 있습니다. 이제 핫플레이트를 켤 준비가 되었으며, 온도를 75 °C로 설정하겠습니다.

온도가 75°C에 도달하면 타이머를 1시간으로 설정하여 PDMS를 경화시킵니다. PDMS를 1시간 동안 경화시킨 후, 핫플레이트 전원을 끄고 50°C까지 식힙니다. 이렇게 하는 이유는 SEA에 균열이 생기는 것을 방지하기 위함입니다.

75°C에서 실온으로 즉시 내린 후, 이제 가열판을 끄고 50°C까지 온도가 내려갈 때까지 기다립니다. 가열판 온도가 50°C까지 내려가면, 투명 필름 위의 무게추를 제거할 수 있습니다. 이제 가열판에서 웨이퍼를 꺼내면 절단 준비가 완료됩니다.

이제 PDMS 시트를 C 8 마스터에서 분리할 준비가 되었으며, 알루미늄 호일을 제거해야 합니다. 그다음 투명 시트를 제거합니다. 여기 표준 관류 챔버가 있습니다.

우리는 이를 정렬할 수 있도록 수정하였습니다. 미세 유체 장치의 구멍, 입구 및 출구 포트입니다. 여기 PDMS 막에 있는 4개의 입구 포트와 1개의 출구 포트가 있습니다.

그리고 이들은 관류 챔버의 4개 유입구 및 1개 유출구와 일치해야 합니다. 이제 관류 챔버를 밀어서 PDMS 막의 구멍들과 맞추겠습니다. 정렬이 완료되었으므로, 이제 절단할 준비가 되었습니다.

이제 챔버를 꺼내고 프로브를 사용하십시오. PDMS 막의 모든 가장자리가 쉽게 제거될 수 있는지 확인하십시오. 그 후, 냉동기를 사용하여 PDMS 막을 제거할 수 있으며, 장치 상단에서 PDMS를 제거할 때 PDMS 막이 찢어지지 않도록 매우 천천히 움직여야 합니다.

이제 SC 8 마스터로 형성된 공동(cavity)이 있는 PDMS 막을 위에 놓고 평평하게 맞춥니다. 이렇게 하는 이유는 홀, 즉 입구 및 출구 포트를 만들 때 커버 슬립과 결합될 PDMS 측면이 거칠어지지 않도록 하기 위해서입니다.

따라서 공동(cavity)이 상단에 위치하도록 해야 합니다. 이제 구멍을 명확하게 확인할 수 있도록 입구 및 출구 포트를 제작하겠습니다. 배경은 검은색으로 설정했습니다.

이제 입구와 출구 포트를 만들 것인데, 포트에 PDMS가 남아 있지 않도록 확인해야 합니다. 따라서 남아 있는 PDMS를 제거합니다. 이제 PDMS 막을 다른 투명 시트로 옮기겠습니다.

따라서 시트와 커버 슬립을 플라스마로 처리한 후, 공동(cavities)이 다시 위쪽으로 오도록 배치합니다. 이렇게 표면과 커버 슬립이 모두 플라스마 처리되면, 두 표면을 결합하여 미세유체 네트워크를 형성하고 PDMS 시트 사이의 기포를 제거할 수 있습니다. 투명도는 스카치테이프를 사용하여 확인할 수 있습니다.

이렇게 하면 PDMS 시트가 평평하게 유지되어 본딩이 훨씬 더 잘 이루어집니다. 그런 다음, 다시 한번 스카치테이프를 상단 표면에 사용하여 PDMS 멤브레인의 먼지를 제거합니다. 이제 PDMS 멤브레인과 본딩할 커버 슬립을 올릴 수 있습니다.

이제 두 개의 PDMS와 유리를 플라스마 처리할 준비가 되었습니다. 마이크로파 변형 플라스마 시스템을 사용하여 PDMS와 커버슬립을 플라스마 처리할 예정이며, 이 시스템의 유리 챔버를 통해 마이크로파 내부에서 플라스마를 생성할 수 있습니다. 샘플을 내부에 배치하고 챔버 내부를 진공 상태로 만들겠습니다.

이제 산소를 흘려보낼 수 있습니다. 이제 플라스마 시스템이 준비되었으며, 플라스마를 시각화하기 위해 이 특정 시스템에서는 10% 전력과 10초의 시간을 사용할 것입니다. 플라스마 처리가 진행되는 동안, 전력을 100%까지 올리고 조명을 껐습니다.

플라스마 처리 직후의 플라스마 상태를 확인할 수 있습니다. 플라스마 처리로 인한 친수성이 소실되기 전에 커버슬립과 PDMS의 양쪽 표면을 즉시 접합해야 합니다. 커버슬립을 배치할 때, 기포 없이 전체 표면이 완전히 접합되었는지 확인하십시오.

공기 방울이 있는 경우 이를 제거하십시오. 이제 5분 동안 그대로 두어 접착되도록 합니다. 여기 PDMS로 챔버 바닥을 수정하여 제작한 수정된 관류 챔버가 있습니다.

이 작업은 앞서 수행되었습니다. 전원을 끈 핫플레이트 위에 투명 필름을 배치했습니다. 그런 다음 이전에 보여드린 것과 유사한 방식으로 준비한 PDMS를 부었습니다.

그런 다음 PDMS 위에 퍼퓨전 챔버를 올리고 여기에 표시된 것처럼 단일 웨이트를 배치한 뒤, 75 °C에서 30분 동안 경화시켰습니다. 이제 PDMS와 커버슬립의 접합이 일어날 때까지 기다리는 동안 챔버를 준비하는 방법을 보여드리겠습니다. 이렇게 하면 챔버와 미세유체 장치를 결합할 수 있습니다.

따라서 필요하지 않은 부분의 과잉 PDMS를 제거해야 합니다. 먼저 투명 필름을 제거한 후 PDMS를 제거하십시오. 그런 다음 입구 및 출구 포트에서 PDMS를 제거해야 합니다. 이제 챔버가 이전에 준비한 미세유체 장치와 본딩될 준비가 되었습니다.

5분 동안 기다렸으므로 이제 미세유체 장치를 투명 필름에서 분리할 준비가 되었습니다. 이때 PDMS와 커버슬립이 서로 떨어지지 않도록 투명 필름을 천천히 제거해야 합니다. 이제 관류 챔버가 준비되었으므로, PDMS를 코팅한 챔버의 바닥면과 PDMS가 부착된 미세유체 장치의 윗면을 플라스마 처리해야 합니다.

이제 이 두 조각을 모두 플라스마 챔버에 넣고 10% power로 10초 동안 플라스마 처리를 하겠습니다. 이제 두 표면 모두 플라스마 처리가 완료되어 접합 준비가 되었습니다. 접합하기 전에, 챔버의 유입구 및 유출구 포트가 미세유체 장치와 일치하는지 확인해야 합니다.

정렬하려는 특징들의 크기가 충분히 크기 때문에, 별도의 특수 장비 없이 육안으로 정렬할 수 있습니다. 정렬 후 챔버 위에 배치하고 모든 표면이 접촉되었는지 확인한 다음 5분 동안 그대로 둡니다. 5분간 대기하면 실험에 충분한 수준으로 본딩이 이루어집니다.

마이크로유체 장치가 챔버와 접합되었으므로, 채널 표면을 친수성으로 만들겠습니다. 이렇게 하면 실제로 A CFS 용액이나 다른 신경전달물질을 흘려보낼 때 용액이 더 쉽게 흐를 수 있습니다. 따라서 장치 전체를 플라즈마 처리기에 넣고 10% 출력으로 1분 동안 플라즈마 처리하여 내부 채널 표면 전체를 친수성으로 만들겠습니다.

그런 다음 물을 채우고 전기생리학 설정 장치로 가져가서 실제 실험을 진행하겠습니다. 이제 전기생리학 설정 장치로 이동하여 뇌 절편과 함께 이 장치를 사용할 준비가 되었습니다. 안녕하세요, 제 이름은 uo입니다.

저는 일리노이 대학교 생명공학과의 Arrington 박사님 및 Fall 박사님과 함께 연구하고 있습니다. 이제 제가 가져온 미세 유체 장치를 사용하여 이 플랫폼 위에서 작업을 진행하겠습니다. 한쪽에는 퍼퓨전 튜브가 보입니다.

반대편에는 흡입 튜브가 보입니다. 장치에는 95% 산소와 5% CO2로 버블링한 CSF 용액을 관류하게 됩니다. 이제 micro V 장치가 준비되었으므로, 뇌 슬라이스를 가져와 micro 장치 위에 올리겠습니다.

이제 뇌 절편을 원형 개구부 위에 올린 다음, 앵커를 사용하여 뇌 절편을 고정하겠습니다. 뇌 절편이 고정되었으므로, 신경전달물질을 사용하여 자극을 주겠습니다. 여기에 네 개의 유입구가 있으므로, 이 네 개의 유입구에서 배출구까지 수동 펌핑을 이용하여 각 유입구에 신경전달물질을 주입하겠습니다.

이제 Fall 박사님께서 이 장치에 대해 설명해 주시겠습니다. 우리에게 왜 이 장치가 그토록 중요한 것일까요? 안녕하세요, 저는 뇌 생리학을 연구하는 Chris Fall입니다.

뇌 절편을 사용하는 이유는 미세 전극 및 이미징 기술을 통한 접근이 가능하기 때문입니다. 지금까지 이러한 뇌 절편의 신경전달물질 환경을 변화시킬 수 있는 유일한 방법은 절편 전체의 흐름을 변경하거나 매우 작은 마이크로 피펫을 사용하여 신경전달물질을 직접 분사하는 것뿐이었습니다. 따라서 저희는 Eddington 연구 그룹과 함께 협력하게 된 것을 매우 기쁘게 생각합니다.

이 새로운 기술을 통해 뇌의 넓은 영역을 다룰 수 있으며, 국소적으로 신경전달물질 환경을 변화시킬 수 있습니다. 그리고 동시에 전극과 이미징 기술을 적용할 수 있으며, 궁극적으로는 동일한 장치 내에 다중 전극 기록 장치를 구축할 수도 있을 것입니다. 여기 마우스 뇌 슬라이스가 미세유체 장치 내에 들어 있는 모습을 보실 수 있습니다.

육안으로 보더라도 뇌가 많은 서로 다른 영역들로 구성되어 있음을 알 수 있습니다. 이러한 영역들은 각기 다른 기능을 수행합니다. 또한 살아있는 동물에서는 뇌의 이러한 서로 다른 영역들이 각기 다른 신경조절 및 신경전달물질 톤을 가지게 됩니다.

그리고 우리는 전기생리학적 기록 및 영상 기록을 수행하는 동안 슬라이스 챔버 내에서 이를 재현할 수 있기를 원합니다. 따라서 서로 다른 농도와 서로 다른 시간 경과에 따라 다양한 신경전달물질로 이러한 각기 다른 영역들을 처리할 수 있다는 점은 매우 유용합니다. 신경전달물질을 실제로 시각화할 수는 없지만, 여기에서 뇌 슬라이스의 서로 다른 영역으로 펌핑되는 형광 염료의 예를 보여드릴 수 있습니다.

여기 장치의 채널을 통해 형광 염료를 흘려보내어 생성된 기공 밖으로 염료가 나오는 모습을 시각화한 영상이 있습니다. 초기 프로토타입임에도 불구하고 유체의 공간 해상도가 얼마나 정밀한지 확인할 수 있습니다. 영상을 통해 염료가 채널로 흘러 들어가 기공 밖으로 나오는 모습을 볼 수 있으며, 이후 염료를 씻어냄으로써 유체의 시간 해상도가 어느 정도인지 가늠할 수 있습니다.

오늘 함께해주셔서 감사합니다. 저희는 미세유체 기술과 마이크로 머신이 어떻게 전통적인 생리학적 기법과 결합하여 뇌의 작동 원리를 이해하는 데 도움을 줄 수 있는지 보여드릴 수 있었다고 생각합니다. 감사합니다.