로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석

본 실험 절차에서는 로봇 공학을 이용하여 식물 조직 내 유전자 발현의 역동성을 시간에 따라 이미지화합니다. 먼저 리마콩 종자를 멸균한 후, 발아를 위해 조직 배양 용기 내의 젖은 종이 타월 사이에 배치합니다. 4일 후, 자엽을 제거하고 GFP가 융합된 프로모터를 포함하는 DNA 컨스트럭트로 Bombardment를 수행합니다. 페트리 접시에 배치된 자엽을 2차원 맞춤형 로봇 이미지 수집 시스템에 장착합니다. 로봇은 100시간 동안 매시간 각 조직 조각의 이미지를 캡처하도록 프로그래밍됩니다.

이미지는 이미지 분석을 거쳐 시간 경과에 따른 GFP 발현 강도의 정량적 데이터를 제공합니다. 안녕하세요, 저는 오하이오 주립대학교 원예 및 작물 과학과의 식물 형질전환 연구실 책임자인 John Finer입니다. 저는 오하이오 주립대학교 연구실의 박사 과정 학생인 Carlos Herandez Garcia입니다.

오늘 Carlos는 녹색 형광 단백질을 이용하여 식물 조직의 유전자 발현을 분석하기 위해 우리가 개발한 프로토콜을 보여줄 것입니다. 우리는 실험실에서 개발한 이 절차를 통해 OD 활성도의 변형을 측정합니다. 이를 위해 우리는 리포터 유전자인 GFP 유전자 상위에 프로모터를 배치했습니다.

리마콩 잎맥(Lima vein)에 프로모터 제어 요소를 도입하고, 맞춤 설계된 로봇 이미지 캡처 시스템을 통해 애플리케이션을 전송하는 방법을 보여드리겠습니다. 마지막으로 이미지 분석 프로토콜을 살펴보며 마무리하겠습니다. 그렇다면 절차를 시작해 보겠습니다. 먼저 표준 절차에 따라 리마콩 종자를 표면 멸균합니다.

멸균된 종자를 젖은 종이 타월 층 사이에 넣어 magenta GA 7 용기에 담고 25 °C에서 4일 동안 배양합니다. 여기서는 프로모터 및 프로모터 요소 분석에 유용한 고복제수 발현 벡터를 사용합니다. 이 벡터는 GFP 유전자를 포함하고 있으며, 이는 입자 충격법(bombardment) 시행 약 1~2시간 전에 형질전환된 조직 내에서 프로모터 또는 프로모터 요소의 기능을 시각화하는 데 사용됩니다.

종피에서 리마콩 CU leadin을 절제합니다. 입자 충격법(bombardment)에 적합한 CU leadin은 절제 직후 노란색에서 연녹색을 띠며 평평해야 하고, 향후 이미지 분석을 방해할 수 있는 손상이 없어야 합니다. MS 염류 B, 5가지 비타민, 3% sucrose 및 0.2% gel rate(pH 5.7)를 포함하는 OMS 배지가 담긴 페트리 접시에 12개의 cu leadin을 놓습니다. 다음으로, M 10 텅스텐 입자에 DNA construct를 침전시킵니다. 우선, 사용 직전에 입자를 멸균수에 재현탁하여 100 mg/mL 농도로 만듭니다.

그 다음 0.6 mL 원심분리 튜브에 입자 25 µL, 1 µg/µL 농도의 DNA 5 µL, 2.5 M 염화칼슘 25 µL 및 100 mM 스퍼민 10 µL를 넣습니다. DNA 준비물을 얼음 위에서 5분 동안 배양한 후, 입자 위에 떠 있는 용액 50 µL를 제거하여 버립니다. 튜브 바닥에 남아 있는 DNA 코팅 입자를 볼텍싱하여 다시 현탁합니다.

Vortexing 직후 2 µL의 Eloqua를 분취합니다. 이 vortexing 단계를 반복하십시오. Eloqua를 분취할 때마다 코팅된 입자는 얼음 위에 보관하고 15분 이내에 사용해야 합니다.

DNA가 입자에 코팅되었으므로, 필터 스크린 중앙에 있는 시린지 필터 상단으로 2 µL의 입자를 넣습니다. 그런 다음 시린지 필터를 입자 유입건(particle inflow gun) 또는 PIG 챔버 내부의 필터 유지 장치에 배치합니다. 비커 바닥에 스크린이 융착된 배플 위에 리마콩 공동 리드(lima bean co leadin)를 축 방향이 위로 향하게 하여 놓습니다.

입자 건 챔버 내에서 조사 동안 조직을 지지하는 플랫폼으로 사용되는 배플을 배치합니다. 조직을 조사하려면 먼저 진공으로 연결되는 밸브를 열어 챔버를 진공 상태로 만듭니다. 진공도가 760 millimeters of mercury에 도달하면, 솔레노이드를 활성화하고 헬륨을 방출하여 입자를 추진시킵니다.

입자를 가속하는 데 사용되는 헬륨 압력은 50~60 PSI입니다. 입자 조사 후, 진공 라인 밸브를 닫고 배기 밸브를 사용하여 진공을 해제하십시오. 진공이 해제되면 챔버 도어를 열어 조사된 co leadin을 회수하고 co leadin을 dal side로 되돌려 놓으십시오.

정량 및 발현 프로파일링을 위해 OMS 배양 배지로 옮깁니다. 모든 DNA 컨스트럭트에 대해 최소 3회 이상 폭격(bombard)합니다. 잘 연구된 유전자 발현 프로파일을 나타내는 양성 대조군도 함께 포함합니다.

이제 공-리딩(co leadin)의 이미징 준비가 완료되었습니다. 수은 램프를 켜고 램프가 예열될 때까지 30분 동안 기다리십시오. SPOT R-T-C-C-D 카메라와 8개의 플레이트를 고정하며 맞춤 설계된 로보틱스 플랫폼의 이동을 제어하는 모터 컨트롤러의 전원을 켜십시오.

MZ L 3 실체 현미경에서 GFP 검출을 위해 들뜸 파장 480 nanometers, 방출 파장 510 nanometers인 GFP two 필터 세트를 선택하여 설정하십시오. 그 다음, 70% ethanol을 분무하여 두꺼운 폴리카보네이트 페트리 접시 뚜껑을 멸균하십시오. 페트리 접시 바닥을 덮는 데 사용되는 이 특수 뚜껑은 이미지 수집 중 결로 현상을 방지합니다.

bombarded cuan이 포함된 플레이트를 로보틱스 플랫폼에 배치하고 측면 고정 나사를 조여 위치를 고정합니다. 이제 로보틱스 플랫폼과 이미지 획득을 모두 제어하는 맞춤형 소프트웨어 애플리케이션을 엽니다. 또한 소프트웨어를 사용하여 소프트웨어 백색광 컨트롤러 스위치를 켜고, 플랫폼을 홈 위치로 정렬합니다.

이 작업은 위치 진입 전에 수행됩니다. 모터 탭의 모든 coddle leadin에 대해 첫 번째 플레이트를 선택하십시오. 플랫폼이 페트리 접시의 중심을 현미경 대물렌즈 아래에 위치시킵니다.

이동 거리 버튼을 사용하여 이미지 수집을 위한 첫 번째 CU LEADIN의 위치를 정밀하게 잡으십시오. 라이브 모드 기능을 사용하여 cuddle leaden을 적절한 관찰 영역으로 이동시킵니다. 첫 번째 cuddle leaden의 경우, 해부 현미경의 수동 노브를 사용하여 초점을 맞추고 배율을 1.6 x로 설정하십시오. 관심 영역이 설정되면 '이 위치 추가' 버튼을 클릭하십시오.

소프트웨어는 이 영역의 좌표를 위치 스케줄 파일에 추가하며, 플랫폼은 플레이트 상의 나머지 모든 coen에 대해 설정된 플레이트 중심 위치로 돌아갑니다. 이동 거리 버튼을 사용하여, 로보틱 플랫폼의 각 플레이트 하단에 위치한 3개의 수동 레벨링 나사로 동일한 플레이트 내 나머지 coan의 초점을 조정하십시오. 모든 coan의 좌표 입력이 완료되면, 위치 스케줄 좌표를 저장하십시오.

동봉된 서면 프로토콜에 설명된 대로, GFP의 경우 청색광인 광원의 종류와 노출 설정 등의 이미지 수집 파라미터를 입력하고 이미지를 저장할 위치를 지정하십시오. 캡처 시간 제어 탭으로 이동하여 이미지 획득 시간 간격과 총 이미지 수집 사이클 횟수를 설정하십시오. 이미지는 일반적으로 100시간 동안 매시간 수집됩니다.

명확하게 정의된 유전자 발현 프로필을 생성합니다. 포지션 스케줄 탭을 열고 run schedule 버튼을 클릭하여 이미지 획득을 시작하십시오. 100시간의 이미지 수집이 끝나면 이미지 수집 시스템을 외부 빛으로부터 차단하십시오.

각각 약 5MB 크기의 고해상도 이미지들이 영상 분석을 위해 준비되었습니다. ImageReady를 사용하여 각 폴더에서 100장의 연속 이미지를 어셈블하십시오. 모든 연속 이미지를 프레임으로 가져오고, 이미지 처리 속도를 높이기 위해 크기를 800 x 600 픽셀로 조정하십시오.

다음으로, 모든 프레임에서 보이며 이미지 참조의 선택된 GFP 스폿을 사용한 새로운 도입 레이어에 마크를 표시합니다. 각 이미지를 수동으로 정렬하고, 정렬이 완료되면 참조로 사용된 레이어를 삭제한 후 파일을 단일 PSD 파일로 저장합니다. 또한, 모든 프레임을 최고 해상도의 단일 MOV 파일로 내보냅니다.

이제 GFP 정량을 시작할 준비가 되었습니다. Image J를 사용하여 MOV 파일을 열고 400 x 300 픽셀 영역으로 크롭하십시오. 그런 다음 RGB split 도구를 사용하여 순차적 이미지들을 적색, 청색, 녹색 채널로 분리하여 적색 및 녹색 채널을 추출하십시오.

각 슬라이스용 배경 형광 제거(subtract measured ROI for each slice) 플러그인 도구를 사용하여 배경 형광을 제거하십시오. 임계값 수준을 조정하고, 픽셀당 평균 그레이 스케일 값과 GFP 발현 픽셀의 총 수를 측정하도록 설계된 플러그인을 사용하여 GFP 발현량을 계산하십시오. ImageJ의 출력값을 복사하십시오. 마지막으로 녹색 및 적색 채널의 출력값을 Microsoft Office에 붙여넣으십시오.

이미지 정렬 결과의 개념을 파악하기 위해 데이터를 추가로 조작하는 과정에 Excel을 사용합니다. 이 첫 번째 애니메이션은 100시간의 실험 동안 로보틱스 플랫폼의 재배치 과정에서 발생하는 부정확성을 보여줍니다. 스폿(Spot)의 움직임은 수동 이미지 정렬 후 로보틱스 플랫폼이 각 시점에서 정확히 동일한 위치로 돌아가지 못해 발생하는 아티팩트이며, GFP 발현 세포를 쉽게 관찰할 수 있고 이 추적 시스템의 고유한 특징들을 쉽게 시각화할 수 있습니다.

이 애니메이션이 반복됨에 따라 원으로 표시된 GFP 발현 세포들을 주목하십시오. 빨간색 원으로 표시된 세포는 포격 후 18~20시간 사이에 발현량이 매우 급격히 감소하는 반면, 흰색 원으로 표시된 세포는 GFP 발현의 시작이 지연됨을 보여줍니다. 애니메이션 외에도, 이 절차를 통해 리마콩 표적 조직 내 GFP 발현의 시간적 변화를 빠르게 정량화할 수 있습니다. 이러한 대표적인 결과는 CAMV 35 S 프로모터와 4가지 서로 다른 콩 프로모터를 사용하여 프로모터 강도를 비교 정량화한 것을 보여줍니다.

지금까지 발아된 촉매(catalin)에 DNA를 도입하는 방법을 보여드렸습니다. 리마콩 종자를 로봇 위에 놓고 촉매를 배치한 후, 이미지 분석을 위한 영상을 수집하고 해당 영상을 분석합니다. 저희 연구실에서는 클론 식물 프로모터를 검증하기 위해 이 절차를 일상적으로 사용하고 있습니다.

다양한 식물 프로모터를 도입하여 방대한 양의 데이터를 생성할 수 있습니다. 하지만 이 과정은 단계가 많고 복잡하여 오류가 발생할 가능성이 높습니다. 따라서 이 절차를 수행할 때는 신선한 강낭콩 종자로 시작하거나, 최소한 적절하게 보관된 고품질의 종자를 사용하는 것이 중요합니다. 또한, Bombard 컷 리드를 빠르게 확보하여 로봇에 설치하고, 응결 문제를 최소화하기 위해 두꺼운 페트리 접시 뚜껑을 사용하는 것이 중요합니다.

마지막으로, 저희가 사용하는 GFP는 하버드 대학교의 Gen HIN Lab에서 제작한 SGFP라는 다른 버전임을 참고하시기 바랍니다. 이 GFP는 안정성이 낮아 유전자 발현의 급격한 변화를 추적하는 데 더 적합할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

그럼, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.