동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

이 비디오 논문의 전반적인 목표는 다음 두 가지 질문에 대한 해답을 제공하는 것입니다. 첫째, 단백질 샘플 중 실제로 다른 단백질과 결합할 수 있는 분율을 측정함으로써 단백질 상호작용 연구의 신뢰도를 높일 수 있는가? 둘째, 키네틱 분석을 통해 구조와 기능의 관계를 어떻게 더 잘 이해할 수 있는가?

이 두 가지 질문은 라벨을 사용하지 않고 단백질 상호작용을 실시간으로 검출하는 장비인 Corp X 100을 이용한 실험에서 다루어질 것입니다. 본 실험에서는 소 유래 cystatin B와 시스테인 프로테아제인 papain의 상호작용을 조사합니다. 두 단백질 복합체의 결정 구조는 프로테아제 결합에 관여하는 여러 잔기들을 보여주며, 이를 통해 각각의 상호작용 잔기가 cystatin B와 papain의 상호작용에 어떤 영향을 미치는지 확인합니다. 부위 특이적 돌연변이 유발법을 통해 여러 cystatin B 변이체를 제작합니다.

이러한 실험에서는 재조합 단백질이 제대로 접히지 않거나 응집 또는 변성되어 부정확하고 재현 불가능한 결과가 나올 가능성이 항상 존재합니다. VIACORE X 100은 CFCA(calibration free concentration analysis)라고 하는 무교정 농도 분석법을 통해 결합 가능한 단백질 분율을 결정할 수 있는 기능을 갖추고 있습니다. 이 접근 방식은 교정 표준 물질을 사용할 수 없는 경우에도 결합 활성이 유지되는 단백질의 농도를 결정할 수 있게 해줍니다.

여기서는 cystatin B 변이체의 농도를 결정하기 위해 CFCA가 사용됩니다. 이 데이터는 BOR X 100을 사용하여 함께 평가하는 Pepin에 대한 cystatin B 변이체의 결합 키네틱스 결정 시 입력값으로 사용됩니다. 안녕하세요, 스웨덴 GE Healthcare의 CLA gram입니다.

오늘 제 동료인 Eva Pool이 BOR X 100을 사용하여 구조-기능 관계 분석을 수행하는 방법을 보여드리겠습니다. 재조합 단백질은 시간이 지남에 따라 잘못된 접힘(folding)이 나타나거나 결합 활성이 저하될 수 있으며, 이러한 현상은 총 농도 측정에 의존하는 방법으로는 감지할 수 없습니다. 이는 결과적으로 캘리브레이션 프리(calibration-free) 농도 분석을 통한 농도 측정 후 잘못된 키네틱 데이터를 도출하는 원인이 될 수 있습니다. B.A core X 100은 cystatin B 변이체와 pepane의 상호작용 키네틱 및 친화도를 분석하는 데 사용됩니다.

이러한 파라미터들은 결합 메커니즘에 대한 통찰을 제공할 것입니다. 먼저 실험 설계에 대해 간략히 설명하며 시작하겠습니다. 두 단백질 복합체의 결정 구조를 통해 밝혀진 바와 같이, 시스테인 프로테아제 파파인과 억제제인 시스타틴 B 사이의 상호작용은 소수성 접촉에 의해 주도됩니다.

억제제 측면에서 접촉 부위는 N-말단과 C-말단의 N-구역 및 두 개의 헤어핀 루프입니다. 본 연구에서는 네 가지 돌연변이체를 조사하였으며, 각 돌연변이체에는 cystatin B의 이량체화를 방지하기 위해 cysteine 3-Serine 돌연변이가 도입되었습니다. 결정 구조에서 밝혀진 맥락을 바탕으로 leucine 73은 glycine으로, histidine 75는 glycine으로, 그리고 tyrosine 97은 alanine으로 치환되었습니다. 두 개의 glycine 돌연변이는 Pepsin 결합에 있어 histidine 75와 leucine 73 측쇄의 중요성을 조사하기 위해 도입되었으며, tyrosine 잔기는 cystatin B의 C-말단과 Pepsin 사이의 상호작용을 연구하기 위해 alanine으로 치환되었습니다.

세 가지 이중 돌연변이체와 INE 3 to Syrian 단일 돌연변이체를 촉매 불활성형 Papain S-methyl papain과의 상호작용에 대해 테스트합니다. 이 단백질 분해 효소의 촉매 불활성 형태는 활성 틈새(active cleft)의 CYS 25에 메틸기가 부착되어 있습니다. 편의를 위해, 프로토콜 전반에 걸쳐 이 변이체를 propan이라고 부르겠습니다.

CFCA는 분석물 분자가 표면으로 확산되는 속도에 의해 전체 속도가 제한되는 조건에서의 결합 속도 측정에 의존합니다. 이는 리간드의 높은 고정화 수준일 때 유리합니다. 고정화 절차를 시작하기 전에, 실험에 사용된 HEPs 완충액을 왼편 트레이에 배치하고 두 튜빙을 모두 삽입하십시오.

또한 오른쪽 트레이에 빈 폐액 병을 배치하십시오. 그런 다음 새 센서 석고 5개를 기기에 삽입하고 core X 100 소프트웨어를 통해 초기화한 후, 시작 화면에서 dock chip tool 항목을 클릭하십시오. 소프트웨어에서 start doc을 클릭하십시오.

다음으로, 시작 화면에서 'coupling to censorship CM five'를 목표로 설정하여 고정화 마법사를 통해 펩타이드 및 고정화를 설정합니다. 'other options' 버튼을 클릭한 다음 'wizards'를 선택하십시오. 그러면 사용 가능한 마법사 창이 나타납니다. 'immobilization'을 선택하고 우측 하단의 'new' 버튼을 클릭하십시오. 고정화 마법사의 첫 번째 화면이 나타나며, 'coupling to sensor gypsum five'가 기본값으로 설정되어 있습니다.

플로우 셀 2에 고정하려면 플로우 셀 2 아래의 확인란을 선택하십시오. 아래의 세 가지 옵션 중 플로우 셀 1은 참조 표면으로 사용하기 위해 수정하지 않은 상태로 둡니다. 오른쪽에 있는 접촉 시간 지정 확인란을 선택하면 대상 레벨이 접촉 시간으로 변경되며, 접촉 시간을 900초로 지정하십시오.

다음으로, 포획 분자/리간드 용액 항목에 고정화 파라미터를 입력하십시오. papain을 입력합니다. 그런 다음 다음 버튼을 클릭하십시오.

다음 화면에 샘플 랙의 배치가 표시됩니다. 1번 위치에는 리간드 papain을 칩 표면에 결합시킨 후 남은 활성 부위를 비활성화하는 데 사용되는 et ethanolamine이 배치됩니다. 1번 위치와 2번 위치에 ethanolamine 용액을 삽입하십시오.

리간드 papain을 준비합니다. papain은 과량의 methyl sulfate에 보관되어 있으며, 10 mM sodium acetate 버퍼(pH 4.5)로 50 µg/mL 농도로 희석합니다. amine coupling kit의 EDC 및 NHS 커플링 시약을 이중 증류수로 재구성합니다. EDC 85 µL를 바이알에 피펫으로 분주합니다. 캡을 닫고 이를 3번 위치에 놓습니다.

4번 위치의 NHS에도 동일한 부피를 사용하십시오. 기기가 이 파일에서 ED, C 및 NHS를 혼합할 수 있도록 5번 파일은 캡을 닫은 상태로 비워두어야 함에 유의하십시오. 또한 H2O 위치의 세척 파일에 신선한 탈이온수를 채우는 것을 잊지 마십시오.

화면의 안내에 따라 랙을 채운 후, 'load samples'를 클릭하고 랙을 기기에 장착하십시오. 랙 장착이 완료되면 'next'를 클릭하십시오. 분석 시작 전 체크리스트가 표시됩니다.

모든 글머리 기호 항목이 충족되었는지 확인하십시오. 시작 버튼을 누르면 작동이 시작됩니다. 작동은 고정화 과정 중에 시작됩니다.

데이터는 실시간으로 수집됩니다. 먼저, 커플링 시약을 주입합니다. 다음으로 펩타이드를 칩 표면에 결합시키며, 남은 활성 에스테르를 비활성화하는 것으로 절차를 마무리합니다.

실행이 완료되면 대화 상자에 실행 결과 요약이 표시됩니다. 이 창에서 고정화 수준을 확인할 수 있습니다. 전체 커플링 과정 결과, 약 3000 RU의 papain이 고정화되어야 합니다.

파파인(papain)이 센서 칩에 고정되면, 시스타틴 B(cystatin B) 변이체 샘플을 300 µL 이상의 부피로 희석하여 총 농도를 약 10 nanomolar로 맞춘 후 CFCA 분석을 시작합니다. 분석 설정 단계에서 나중에 사용하게 되므로 희석 배수를 기록해 둡니다. 분석 폴더의 농도 섹션에서 이전 섹션에 설명된 대로 마법사 대화 상자를 호출하여 시작합니다.

'Calibration free'를 선택한 후 'New'를 선택합니다. 마법사의 첫 화면에 주입 시퀀스가 나타납니다. 여기서는 센서 칩 CM5와 직접 고정화 분석법을 사용하므로 설정값은 변경하지 않고 그대로 둡니다.

다음 화면에서 'next'를 클릭하십시오. 'prime before run'과 'run startup cycles' 체크박스를 선택된 상태로 둡니다. 또한, 기본 시작 사이클 횟수를 3회로 유지하십시오.

용액 이름 필드에 heaps buffer를 입력하십시오. 그런 다음 다음을 클릭하십시오. 다음 화면에서 재생 용액의 이름인 20 millimolar sodium hydroxide를 입력하십시오.

다른 파라미터는 변경하지 않은 상태로 둡니다. 다음을 클릭하여 샘플 테이블을 확인하십시오. 샘플 테이블에 따라 샘플을 준비합니다.

샘플 표의 각 행은 두 번의 사이클로 수행됩니다. 하나는 10 µL/min의 유속으로, 다른 하나는 100 µL/min의 유속으로 진행합니다. 분석은 공시료(blank)로 시작하십시오.

그 다음 희석 배수, 20 °C에서의 확산 계수 및 분자량을 입력합니다. 각 돌연변이체의 확산 계수는 제품 웹사이트의 웹 도구를 사용하여 계산할 수 있습니다. 이 도구로 연결되는 링크는 소프트웨어의 서포트 네비게이터(support navigator)에 제공됩니다.

각 샘플과 중복 시료를 함께 실행하는 것이 권장되므로, 공백 행부터 마지막 샘플까지 표 전체를 복사하여 표 하단에 붙여넣으십시오. 다음으로 진행하려면 '다음(next)'을 클릭하십시오. 다음 화면에 샘플 랙이 표시됩니다.

소프트웨어에 명시된 배치도에 따라 랙에 샘플과 시약을 배치하십시오. 샘플 로드 버튼을 눌러 랙을 장비에 로드하십시오. 그런 다음 다음을 클릭하십시오.

샘플을 로딩한 후, 체크리스트가 포함된 알림 화면이 표시됩니다. 모든 항목을 확인한 다음 시작 버튼을 누르십시오. 데이터는 실행 중에 실시간으로 수집됩니다.

실행이 완료되면 수집된 데이터가 표시되는 창을 닫으십시오. 메인 창에 새로운 결과 항목이 나타났는지 확인하십시오. 데이터로부터 농도를 계산하려면, 새로운 결과 항목을 선택하고 버튼을 클릭하십시오.

core X 100을 통해 평가합니다. 평가 소프트웨어를 실행하여 툴바에서 수집된 모든 데이터를 표시한 다음, 메뉴에서 농도 분석(concentration analysis)을 선택하고 이어서 캘리브레이션 프리(calibration free)를 선택합니다. 첫 번째 창에서 분석에 포함할 데이터를 선택하십시오.

목록을 스크롤하고 뷰 목록을 단계별로 확인하여 모든 샘플의 데이터를 검토하십시오. 제외하고 싶은 데이터가 있는 경우, 목록에서 체크 표시를 해제하십시오. 계산을 시작하려면 다음을 클릭하십시오.

CFCA 상호작용 모델은 실험 데이터에 자동으로 피팅되며, 피팅이 완료되면 결과 창에 각 샘플에 대한 결과가 표시됩니다. 테이블에서 해당 행을 선택하여 각 샘플의 피팅 과정을 단계별로 확인하십시오. 'measured concentration'이라고 표시된 열은 분석된 샘플 내의 농도를 나타냅니다.

원본 샘플의 농도는 앞서 입력한 희석 배수를 사용하여 계산되며, 완료되면 '계산된 농도(calculated concentration)' 열에 표시됩니다. '완료(finish)'를 클릭하여 결과를 저장하십시오. CFCA 분석을 통해 단백질의 농도를 파악했으므로, 이제 이후의 동역학적 측정을 위한 훌륭한 기반이 마련되었습니다. 이제 동역학 분석을 통해 결합 메커니즘에서 주요 아미노산 잔기의 중요성을 이해할 수 있을 것입니다.

동역학 분석 설정을 시작해 보겠습니다. 동역학 분석은 시작 화면에서 새로운 CM5 센서 칩을 기기에 장착하는 것으로 시작합니다. 동역학 친화도 분석을 위한 분석 워크플로를 생성하십시오.

왼쪽 상단 모서리에 리간드 정보를 입력하는 대화 상자가 나타납니다. 리간드 이름 입력란에 papain을 입력하고 종 유형 목록에서 다른 단백질을 선택하십시오. 그런 다음 제시된 두 가지 대안적인 리간드 부착 방법 중에서 sensor chip CM5를 사용하여 리간드를 공유 결합으로 고정(immobilize ligand covalently)하는 옵션을 선택하면, 권장 분석 워크플로가 창의 오른쪽에 표시됩니다.

고정화 단계로 시작하여 이후 분석 단계가 이어집니다. 계속하시려면 '계속' 버튼을 누르십시오. 이름 입력 후 '저장' 버튼을 눌러 요청된 대로 분석 워크플로를 저장하십시오.

이제 소프트웨어에 각 단계별 버튼이 포함된 분석 워크플로가 표시됩니다. 센서 표면 준비의 첫 번째 단계는 가동화 pH를 찾는 것입니다. 이 pH 값을 이미 알고 있는 경우, 나타나는 대화 상자에서 '알려진 값 입력(enter known value)'을 누르십시오.

버퍼 이름에 acetate와 pH 4.5를 입력하고 save를 선택하십시오. 이제 assay 워크플로우에 녹색 체크 표시가 나타나 이 단계가 완료되었음을 나타냅니다. 이제 고정화 단계의 run 버튼을 눌러 고정화를 진행하십시오.

여기서는 프로판 및 CFCA 분석용 고정화에 사용되었던 것과 동일한 마법사가 나타납니다. 키네틱 분석을 위한 파핀(papin) 고정화 역시 동일한 방식으로 설정되지만, 더 낮은 농도의 용액을 더 짧은 시간 동안 주입한다는 점이 다릅니다. 이는 파핀의 고정화 양을 줄여 시스타틴(cystatin) 돌연변이체의 결합 속도가 확산에 의해 제한되는 상황을 방지함으로써, 키네틱 데이터를 독립적으로 측정하기 위함입니다. 리간드의 이름과 고정화 pH는 분석 워크플로의 이전 단계에서 이미 입력되었으므로, 여기서는 두 항목 모두 미리 설정되어 있습니다.

유일하게 필요한 업데이트는 접촉 시간을 50초로 설정하는 것입니다. 그 후 고정화는 이전에 설명한 대로 진행합니다. 고정화 후 예상 결합 수준은 50 R ru입니다.

실행 버튼 옆에 녹색 체크 표시가 나타나면 고정화가 완료된 것입니다. 다음으로, 워크플로우의 해당 단계에서 재생 용액을 입력하십시오. 나타나는 대화 상자에서 알려진 값 입력(enter known values)을 클릭하여 재생 조건을 찾으십시오.

재생 용액과 접촉 시간을 입력하십시오. 그런 다음 저장 버튼을 클릭하십시오. 리간드가 고정되었고 재생 조건이 입력되었으므로, 이제 kinetics 데이터 생성을 위한 모든 준비가 완료되었습니다. run kinetics Affinity assay 상자에서 run 버튼을 눌러 kinetics의 첫 번째 단계를 시작하십시오.

Affinity wizard는 여기서 사용되는 단일 사이클 키네틱스(single cycle kinetics)의 매 사이클별 주입 순서를 안내하므로, 아무것도 변경할 필요가 없습니다. 'Next'를 클릭하여 진행하십시오. 다음 단계에서는 분석 전 시스템 프라이밍(priming)을 나타내는 기본 설정을 그대로 유지하십시오.

칩 표면을 평형 상태로 만들기 위해 스타트업 사이클을 1회 실행하도록 선택하십시오. 다음으로, 샘플에 대한 주입 파라미터를 정의합니다. 재생 용액은 앞서 지정되었으며 설정이 미리 정의되어 있으므로, 화면의 파라미터를 변경할 필요는 없습니다.

다음 버튼을 클릭하십시오. 마지막으로, 샘플을 지정합니다. 각 돌연변이 변이에 대해 두 개의 행을 입력하십시오. 하나는 공백으로 두고, 다른 하나에는 샘플을 입력합니다.

최고 농도 파라미터를 0으로 설정하여 공시료 사이클을 지정합니다. 각 런(run)에서 두 가지 Cystatin B 변이체를 적합시킬 수 있습니다. 각 돌연변이에 대해 분자량, 최고 농도 및 희석 배수를 입력한 후 'Next'를 누르십시오.

다음 화면에 샘플 랙이 표시됩니다. 단백질 샘플의 희석 시리즈를 준비하고 캡이 닫힌 바이알을 랙에 배치하십시오. 화면에 표시된 대로, 13번 위치에는 버퍼가 담긴 바이알을, 14번 위치에는 재생 용액이 담긴 바이알을 배치합니다. 워터 포지션에는 반드시 신선한 물을 채우십시오.

랙을 기기에 넣고 '샘플 로드' 버튼을 눌러 샘플을 적재한 후 '다음'을 클릭하십시오. 이전과 마찬가지로, '시작'을 눌러 실험을 진행하기 전에 최종 점검을 수행하며, 상호작용 데이터는 실시간으로 나타납니다. 실행이 완료되면, 방금 시연한 것과 동일하게 나머지 cystatin B 변이체들의 실행을 즉시 진행하십시오.

남은 cystatin B 변이체들을 연속적으로 실행하는 경우, 해당 단계의 체크 박스를 해제하여 프라임 단계와 스타트업 사이클을 생략하십시오. 각 실행이 완료되면 링크를 통해 데이터에 액세스할 수 있습니다. 모든 결과는 분석 워크플로우에 포함됩니다.

이 워크플로우 내에서 생성된 모든 결과가 포함된 대화 상자가 나타납니다. 속도 상수를 계산하려면 평가할 결과를 선택하고 evaluate를 누르십시오. 그러면 core X 100 평가 소프트웨어가 다시 시작되어 모든 수집된 데이터를 표시합니다. 툴바 메뉴에서 kinetics affinity를 선택하십시오.

첫 번째 화면에서는 cysteine three to Syrian 돌연변이를 평가 대상으로 선택합니다. 클릭하여 'Next'를 누르면 이 돌연변이에 대해 수행된 공시료(blank) 실행 데이터가 함께 표시됩니다. 다음 화면에서는 샘플 실행 데이터에서 공시료 실행 데이터를 뺀 결과 데이터가 표시됩니다.

kinetics 버튼을 클릭하여 동역학 평가를 선택하십시오. 이제 데이터를 1:1 상호작용 모델(one-to-one interaction model)에 맞게 피팅하도록 선택하십시오. fit 버튼을 클릭하면, 계산되는 대로 피팅 결과가 화면에 표시됩니다.

준비가 완료되면 품질 관리 항목이 자동으로 적용되어 하단에 표시됩니다. 품질 관리 항목들을 검토한 후, 센서그램 데이터의 곡률이 충분한지 확인하십시오. 또한, 수집된 데이터와 피팅 모델 간의 차이를 보여주는 잔차 플롯을 확인하십시오.

체계적이고 비무작위적인 편차에 주의하십시오. 이 피팅은 수용 가능합니다. 이제 리포트 탭의 키네틱 데이터를 확인하십시오.

결합 속도 상수, 해리 속도 상수 및 평형 해리 상수입니다. 완료되면 완료 버튼을 누르고 다른 모든 돌연변이에 대해 동일한 절차를 반복하십시오. 여기 조사된 다양한 cystatin B 변이체에 대한 CFCA 분석의 대표적인 결과가 있습니다.

특이적 결합 농도 데이터는 분당 10 및 100 µL의 유속에서 얻은 센서그램으로부터 추출되었습니다. 2단계 80 측정으로 결정한 농도와 CFCA로 결정한 농도를 비교하면, 대부분의 경우 leucine 73 glycine 변이체의 단백질이 완전히 활성화되어 있는 반면, 활성 단백질의 비율은 매우 낮다는 것이 분명합니다. pepsin에 결합하는 cystatin B 변이체의 반응 속도론은 단일 주기 반응 속도론(single cycle kinetics)을 사용하여 결정합니다.

센서그램은 공백 및 참조값이 차감된 데이터와 함께 검은색으로 겹쳐진 1:1 상호작용 모델의 반응 속도론을 보여줍니다. CFCA로 측정한 leucine 73 변이체의 특이적 결합 농도는 280 nm 측정으로 결정된 총 단백질 농도의 약 10%에 불과합니다. 반응 속도 매개변수 계산 시 정확한 농도를 사용하면, leucine 73의 결합 속도가 다른 변이체들과 유사하다는 점이 명확해집니다.

돌연변이체의 결합 속도는 야생형 단백질과 유사하지만, 돌연변이체의 해리 속도 상수는 최대 두 자릿수 가까이 더 높을 수 있으며, 이에 따라 평형 해리 상수 또한 증가합니다. 친화도의 감소는 주로 해리 속도의 증가에 기인하는데, 이는 두 번째 결합 루프와 cystatin B의 C 말단 끝 모두가 일단 복합체가 형성된 후 억제제가 효소에 부착된 상태를 유지하게 함으로써 결합 친화도에 기여함을 나타냅니다. 돌연변이체 중 하나가 매우 낮은 결합 활성을 보이는 것으로 나타났기 때문에, 이러한 결론을 내리는 데 있어 캘리브레이션 프리 농도 분석(calibration free concentration analysis)의 사용이 필수적이었습니다. 동료인 Pol이 구조적 기능 연구에서 bi core X 100을 사용하는 방법을 설명해 드렸을 것입니다. 이러한 실험을 수행할 때, 농도 분석과 속도론적 분석 모두 동일한 결합 절차를 기반으로 하지만 실험 조건은 상당히 다르다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.