구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 구조 질량 분석법을 사용하여 거대 단백질 복합체를 특성화하는 것입니다. 이는 나노 흐름 전기 분무 이온화를 위한 금 도금 모세관을 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 시료를 준비하고 고질량 측정을 위해 질량 분석기를 보정합니다.

다음으로, 기상에서 단백질 복합체를 온전하게 유지하기 위해 실험 조건을 최적화합니다. 이후 MS 및 탠덤 MS 스펙트럼을 획득합니다. MS 스펙트럼에서는 온전한 복합체의 질량에 해당하는 전하 상태가 나타났으며, 탠덤 MS 실험에서는 단량체 및 탈착된 복합체의 결합 패턴이 확인되었습니다.

안녕하세요, Whiteman 과학 연구소 Miron 연구실의 Naam Kiba입니다. 그리고 저는 Isaac Ky이며, 저 또한 michelon 연구실 소속입니다. 오늘은 구조 질량 분석법을 적용하여 거대 단백질 복합체를 분석하는 기본 절차를 보여드리고자 합니다. 저희 연구실에서는 단백질 복합체의 전반적인 기하학적 구조, 조성 및 상호작용 네트워크를 정의하기 위해 이 절차를 사용하여 단백질 복합체의 특성을 분석합니다. 그럼 시작해 보겠습니다.

비전류 결합 단백질 복합체 분석은 as emme plus 또는 a qua 모세관을 이용한 공기 분사 면역법으로 수행됩니다. 이 모세관 C는 직경 약 1 micron의 미세한 팁으로 연신한 후 금과 같은 전도성 물질로 코팅할 수 있습니다. 이러한 모세관은 여기에서 보시는 바와 같이 시판되고 있습니다.

하지만, 이 방법은 비용 효율성이 훨씬 더 높습니다. 유리 모세관은 냉각 및 코팅을 통해 즉시 사용 가능한 상태로 만들 수 있으며, 냉각은 이 니들 풀링 장치에서, 코팅은 이 코팅 장치에서 수행됩니다. 이 절차를 시작하려면, 페트리 접시 바닥에 양면 접착 패드 두 조각을 2 cm 간격으로 부착하십시오.

패드 중 하나의 중앙에 유리 막대를 놓습니다. 접착 패드는 모세관을 고정하며, 유리 막대는 준비된 모세관을 지지하여 모세관 끝이 부러지지 않도록 유지합니다. 외경 1 mm 및 내경 0.78 mm의 보로실리케이트 유리 모세관을 사용하였습니다.

모세관 하나를 바늘에 삽입하고, 모세관을 부드럽게 고정한 뒤 가열 필라멘트의 중심에 위치하도록 조정합니다. 모세관의 양 끝이 단단히 고정될 때까지 클램프를 부드럽게 조입니다. 여기에 표시된 사전 정의된 프로그램을 사용하여 모세관을 당깁니다.

하지만 풀러(puller)를 프로그래밍하는 과정은 시행착오의 연속이라는 점을 기억하십시오. 만족스러운 팁 모양이 얻어질 때까지, 모세관을 한 번 당길 때마다 두 개의 최종 형태 모세관이 생성됩니다. 기기에서 당겨진 모세관들을 꺼내어 팁을 검사하고, 변형되었거나 파손된 것은 폐기하십시오.

끝이 뭉툭한 포지셔닝 핀셋을 사용하여 모세관을 페트리 접시에 배치합니다. 접착 패드에 부착된 모세관의 하단은 고정하고 상단은 유리 막대에 기대어 팁이 위를 향하게 합니다. 페트리 접시가 가득 찰 때까지 모세관 배치를 계속합니다.

지름 10 centimeter 접시에 약 80개의 모세관이 들어갑니다. 다음으로, 모세관을 금으로 코팅합니다. 플레이트를 금 스퍼터 코터에 넣습니다.

제조업체의 지침에 따라 가스 공급원을 선택하고 미리 정의된 코팅 사이클을 활성화하십시오. 모세관이 균일하게 금색이 될 때까지 코팅을 3~6회 반복합니다. 모세관 준비가 완료되면 질량 분석기의 보정을 진행하십시오.

MultiPro 복합체에 대해 수행되는 대부분의 실험은 이와 같은 Electrospray quadruple time of flight 질량 분석기를 사용하여 수행됩니다. 이는 고질량 분석을 위해 수정된 Waters 사의 입력 장치입니다. 단백질 시료를 로딩하기 전에 요오드화 세슘을 사용하여 질량 분석기를 교정하십시오.

먼저, 정제수에 세슘(caesium) 100 mg/mL 용액을 준비합니다. 세슘은 높은 질량 보정을 위해 사용됩니다. 이는 단일 전하 염 클러스터가 393 m/z에서 10,000을 훨씬 넘는 광범위한 질량 범위에 걸쳐 형성되기 때문입니다. 뭉툭한 핀셋을 사용하여 페트리 접시에서 코팅된 모세관을 꺼내고, 세슘 용액 2 µL를 모세관에 로딩합니다.

minor gel이 로딩된 팁을 사용하십시오. 수동으로 또는 스핀 다운 어댑터를 사용하여 용액을 모세관 끝부분으로 밀어냅니다. 모세관을 모세관 홀더에 삽입하고, 팁이 홀더 가장자리로부터 약 10 millimeters 떨어진 위치에 오도록 모세관을 조정하십시오.

모세관을 광학 현미경 아래에 두고 끝이 뾰족한 AA 타입 핀셋을 사용하여 끝부분을 다듬습니다. 흐름을 방해할 수 있는 기포가 모세관 내에 없는지, 그리고 모세관이 막히지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한, 모세관에서 금 코팅이 벗겨지지 않았는지 확인하십시오.

만약 그렇다면, 모세관을 교체하거나 팁을 다듬어 코팅되지 않은 부분을 제거하십시오. 다음으로, 모세관 홀더를 나노 유량 ESI 인터페이스에 연결하십시오. 모세관의 손상을 방지하기 위해 XY, Z 스테이지를 뒤로 회전시킨 후, 스테이지를 활성화 위치로 밀어 넣으십시오.

모세관은 콘 오리피스로부터 1~10 mm 거리에 위치시켜야 합니다. 스프레이가 시작될 때까지 모세관 전압과 낮은 나노 유량 압력을 가합니다. 그 후 나노 유량 압력을 최소값까지 낮추어 조정합니다.

XYZ 스테이지의 위치, 모세관 전압, 나노 유량 압력 및 탈용매 가스 유량을 조정하여 신호 강도를 최적화하십시오. 광범위한 질량 범위의 계절적 피크 시리즈를 검출하려면 가속 전압을 최적화해야 합니다. 여기에 사용된 파라미터는 모세관 1.3 to 1.7 kilovolts, 샘플 콘 80 to 150 volts, 추출 콘 1 to 3 volts이며, 이는 부드러운 탈용매 조건이 필요한 고질량 이온의 투과율을 최적화하기 위한 것입니다.

소스와 분석기 사이의 초기 진공 단계에서 배킹 압력을 5~6 millibar로 높입니다. 배킹 압력을 높이려면, 신호 강도에 미치는 영향을 모니터링하면서 격리 밸브를 부분적으로 닫아 스크롤 펌프로 연결되는 소스 진공 라인의 컨덕턴스를 조심스럽게 감소시키십시오. 질량 분석기 설정이 완료되면, 마스터 전하비 범위를 1000에서 15,000 사이로 설정하여 초당 1회 스캔으로 약 30회의 스캔을 수집하십시오. 수집 후에는 적절한 보정 표를 사용하여 비행 시간(time of flight)을 보정하십시오.

검정이 완료되었으므로 단백질 시료를 로딩할 수 있습니다. 시료는 질량 분석기를 검정하기 전에 준비하며, 낮은 마이크로몰(µM) 농도가 필요합니다. 필요한 경우, 원심 분리 초여과 장치를 사용하여 시료를 농축하십시오.

사용 전 단백질 복합체가 장치의 막에 흡착되지 않았는지 확인하십시오. 부피와 UV 흡광도만으로 확인이 가능하므로 NESI에는 휘발성 용액만 사용할 수 있으며, 이로 인해 완충액 교환이 필요한 경우가 많습니다. 모든 염, 완충액 분자 또는 기타 비휘발성 부가물을 제거하기 위해 마이크로 원심분리 겔 여과 컬럼을 사용할 수 있습니다.

그 대신, 샘플을 현탁시키십시오. 수성 아세트산 암모늄 용액을 사용합니다. 이 중요한 단계가 스펙트럼의 품질을 결정합니다.

최대 교환이 이루어질 때까지 장치당 1.3배 미만의 최소 희석으로 버퍼 교환을 최대 3회 반복합니다. 농축과 버퍼 교환이 모두 필요한 경우, 이 섹션의 시작 부분에서 보여준 것과 같이 원심 분리 초여과법을 사용하여 동시에 수행할 수 있습니다. 다음으로, 요오드화 세슘 보정 시와 같이 샘플을 로드하고 분사를 시작합니다.

신호가 검출될 때까지 스프레이의 초기 최적화를 수행하십시오. M이 복합체의 질량인 평균 전하 상태 식을 사용하십시오. 다만 Dalton 단위에서 전하 상태의 정확한 위치는 단백질에 따라 다릅니다.

복합체 해리를 방지하기 위해 철 공급원을 가열하지 마십시오. 히터를 끄거나 온도를 40 °C 미만으로 유지하십시오. 모세관 위치, 샘플 콘 및 추출기 전압을 변경하십시오.

철 투과율을 극대화하려면 추출 원뿔 전압 100 V, 원뿔 전압 1 V, 모세관 전압 1.5 kV를 시작점으로 설정할 수 있습니다. 이에 따른 스펙트럼의 변화를 확인하십시오. 탈용매화(desolvation)를 개선하고 잔류 수분 및 버퍼 성분을 제거하기 위해 이러한 파라미터들을 나노 유량 압력과 조합하여 최적화하십시오.

충돌 셀의 가스 압력 내 바이어스 전압을 높입니다. 전형적인 바이어스 전압은 트랩 가스 유량이 1 to 10 milliliters per minute일 때 10 to 100 volts 범위 내입니다. 복합체의 결합을 방지하기 위해 이 과정을 주의 깊게 수행하고, 트랩 및 전송 충돌 에너지를 조정하십시오.

고질량 이온의 전송을 위해서는 보통 10에서 30 volt 범위의 더 높은 전압이 필요한 경우가 많습니다. 이때, 여기에서 보여주는 것과 같이 복합체의 충돌 유도 해리를 방지하는 것이 중요합니다. 안정적인 신호가 도달하면, 안정적인 스프레이를 유지하면서 나노 흐름 압력과 모세관 전압을 최소값으로 낮추는 것이 권장됩니다.

여러 번의 스캔을 수집한 후, 텐덤 질량 분석법을 통해 복합체의 구성 성분을 식별합니다. 단백질 복합체에 대해 최적의 안정적인 신호를 얻었다면, 전구 이온을 선택하고 분리 너비 내의 질량 중심을 설정하십시오. 일반적으로 낮은 질량 분해능의 경우 12, 높은 질량 분해능의 경우 13에서 15 사이를 사용하며, 넓은 질량 범위를 사용하여 고질량 저전하 해리 생성물을 검출한 다음, ms를 수행하기 위해 원하는 값으로 범위를 줄입니다.

MS는 전구체 철을 해리시킵니다. 충돌 에너지(CE로 약칭)와 충돌 셀의 압력을 높임으로써, 트랩 또는 전이 CE를 10~20 V 단계로 점진적으로 증가시키고 충돌 가스 압력을 0~5 mL/min으로 높입니다. 최적의 활성화 조건에 도달할 때까지 스펙트럼의 변화를 모니터링합니다. 높은 활성화 에너지는 온전한 복합체로부터 하나 이상의 하위 단위의 해리를 유도하여 서로 다른 하위 단위 간의 상호작용 친화도를 명확히 할 수 있습니다.

ms MS 분석을 위해 둘 이상의 전하 상태를 선택하십시오. 성분이 겹치는 경우, 일련의 탠덤 MS 스펙트럼을 획득하면 서로 다른 군집의 전하 시리즈를 분석하는 데 도움이 됩니다. 또한, 전하 상태가 높을수록 전하 상태가 낮은 경우보다 더 쉽게 해리되므로 MS와 ms를 중첩하여 분석하십시오.

선택한 전구 이온의 분리를 검증하기 위한 MS 스펙트럼입니다. MS 및 ms/MS를 이용한 온전한 복합체의 특성 분석 외에도, 완만한 변성 조건하에서 MS는 더 작은 하위 복합체와 용액을 생성하며, 이에 대한 특성 분석 또한 수행합니다.

하위 복합체의 MS 및 ms MS 분석은 복합체의 서브유닛 구조를 정의하는 기초가 됩니다. 서브유닛 간의 상호작용을 점진적으로 부분 해체하기 위해, 유기 용매를 최대 50% 농도까지 서서히 추가하거나, 암모니아 또는 포름산을 최대 4% 농도까지 추가하여 용액의 pH를 변경합니다. 마지막으로, 복합체를 구성하는 개별 서브유닛의 질량을 결정하기 위해서는 변성 조건에서 스펙트럼을 획득하는 것이 중요합니다. 이는 1% formic acid가 포함된 25~75 비율의 물 및 acetonitrile 용리 용매를 사용하는 zip tip C4를 통해 수행할 수 있습니다. 수집된 모든 데이터는 동봉된 서면 프로토콜에 상세히 설명된 대로 처리하고 분석하십시오. 단백질 복합체 시료를 로딩하기 전, 질량 분석기는 cesium iodide를 사용하여 교정되었습니다.

빨간색으로 표시된 동일한 간격의 피크 시리즈는 393의 마스터 전하비부터 10,000을 훨씬 상회하는 넓은 범위에 걸쳐 나타납니다. 이들은 일반적인 조성의 세슘 플러스 복합체인 단일 전하 염 클러스터로 할당됩니다. 검은색으로 표시된 주요 피크들 사이의 추가 신호들은 세슘 투 플러스 복합체 및 세슘 쓰리 플러스 복합체 시리즈의 이중 및 삼중 전하 종에 의해 발생합니다.

고질량 클러스터를 검출하기 위해서는 초기 진공 단계의 압력을 높이는 것이 필수적입니다. 1.2 및 5.3 millibar의 압력 읽기 값을 통해 고질량 피크에 미치는 압력의 영향이 여기서 입증됩니다. 더 높은 압력에서의 질량 분석 스펙트럼이 여기에서 확대되어 표시됩니다.

다음은 3000에서 5,000 사이의 질량 대 전하비(m/z) 범위에서 전하 상태 분포를 나타내는 렉틴 변이체 복합체의 질량 분석 예시입니다. 하지만 이온의 탈염이 불충분하여 피크가 넓게 나타납니다. 바이어스 전압을 4V에서 15V로 높여 가속 조건을 강화하면 잔류 수분과 완충액 성분이 제거되어 분해능이 높은 스펙트럼을 얻을 수 있으며, 측정된 질량은 5량체 복합체에 해당합니다.

그 후 탠덤 MS 분석을 위해 +15 전하 상태가 선택되었습니다. 충돌 에너지의 증가는 1,664 질량 대 전하비(mass charge ratio)를 중심으로 하는 고전하 단량체의 방출과 5,000에서 8,000 질량 대 전하비 범위의 탈착된 4량체 복합체의 방출을 유발합니다. 렉틴 변이체 복합체 또한 변성 조건 하에서 조사되었으며, 이는 복합체 결합으로 이어졌습니다.

이러한 방식으로 복합체를 구성하는 개별 서브유닛의 정확한 질량을 결정할 수 있습니다. 지금까지 고질량 이온의 MS 및 탠덤 MS 스펙트럼을 획득하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 샘플을 적절히 준비하고 질량 분석법과 호환되는 휘발성 버퍼만을 사용하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.