안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

E Coli RP 4 37을 정의된 공간적 농도 구배에 노출되는 화학주성 장치에 도입합니다. 챔버로 진입하는 세포들은 농도 구배의 중간 지점에 도달하게 됩니다. 신호가 유인 물질로 인식되는지 또는 기피 물질로 인식되는지에 따라, 박테리아는 농도 구배를 따라 빠르게 위 또는 아래로 이동합니다.

안녕하세요, Texas A&M University의 분자 시스템 생명공학 연구실 및 화학공학과에서 온 Derek Engler입니다. 오늘은 미세유체 장치를 이용해 박테리아의 화학성(chemotaxis)을 조사하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 E. coli RP437이 황산니켈의 농도 구배에서 어떻게 이동하는지 연구합니다.

그럼 시작해 보겠습니다. 유체층과 제어층은 SU-8 마스터로부터 Polymethyl SUBOXANE 또는 PDMS를 복제 성형하여 제작합니다. 이 절차를 시작하려면, PDMS 프리폴리머와 가교제를 10:1의 중량비로 혼합하십시오.

기포가 제거될 때까지 데시케이터에서 혼합물을 1시간 동안 탈기합니다. PDMS 혼합물이 준비되면, 페트리 접시에 SU8 마스터를 놓고 그 위에 혼합물을 원하는 두께로 조심스럽게 붓습니다. PDMS와 SU8 마스터 몰드가 담긴 페트리 접시를 80 °C에서 2시간 동안 가열하여 PDMS를 경화시킵니다.

2시간 후, 핫플레이트에서 경화된 PDMS로 덮인 SU-8 마스터를 제거하고 SU-8 마스터에서 PDMS 몰드를 떼어냅니다. 원하는 구조가 PDMS 몰드 내에 형성되어 있을 것입니다. 20게이지 뭉툭한 끝바늘(blunt end needle)을 사용하여 PDMS 몰드에 구멍을 4개 뚫어 구배 발생기(gradient generator), 세포 주입구 및 세포 배출구로 연결될 튜브를 삽입합니다. 이제 PDMS 장치를 결합하여 본딩할 준비가 되었습니다.

먼저, 유리 현미경 슬라이드를 이소프로판올로 세척하고 Airstream으로 건조합니다. 다음으로, PDMS 몰드와 유리 슬라이드를 플라즈마 식각기(plasma etcher)에서 약 30초 동안 산소 플라즈마에 노출시킵니다. PDMS 몰드를 유리 슬라이드에 접촉시킵니다. 접촉된 슬라이드와 PDMS 몰드를 핫플레이트 위에서 65 °C로 15분 동안 가열합니다.

PDMS 장치를 조립하려면, 면도날을 사용하여 현미경 설정에 따라 필요한 적절한 길이로 튜브를 45도 각도로 절단하십시오. 그런 다음 포셉을 사용하여 튜브의 한쪽 끝을 장치에 뚫린 4개의 구멍 중 하나에 삽입하십시오.

둔탁한 30 gauge 바늘 허브를 튜브의 반대쪽 끝에 삽입합니다. 나머지 모든 구멍에 대해 튜브와 바늘 허브 삽입 과정을 반복합니다. 3 mL 주사기에 1 mL의 chemo taxes, 완충액 또는 CB를 채웁니다.

주사기에서 공기를 제거하는 데 주의하십시오. 피펫을 사용하여 출구 바늘 허브에 CB를 추가하고, 바늘 허브를 가볍게 두드려 기포를 제거합니다. 3 mL 주사기 팁에서 CB를 소량 밀어낸 후, 공기가 유입되지 않도록 주사기를 바늘 허브에 연결하십시오.

모든 남은 니들 허브가 CB로 채워질 때까지 장치에 CB를 밀어 넣습니다. 이렇게 하면 대부분의 기포가 제거됩니다. 다음으로, 테스트하려는 화학 효능제(chemo effector)가 적절한 농도로 포함된 CB를 500 µL 시린지 두 개에 채웁니다.

시린지 내용물을 소량 밀어내어 바늘 허브에 맺힌 액체 방울에 접촉시켜 공기 방울 형성을 제거하고 시린지를 장착하여 운동성이 높은 박테리아를 준비합니다. 화학성(chemotaxis) 실험을 위해, 다음 날 32 °C에서 진탕 배양하며 GFP 발현 플라스미드가 포함된 e coli RP 4 37을 트립톤 브로스(tripton broth) 또는 TB에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이 하룻밤 배양액을 사용하여 250 mL 삼각 플라스크에 담긴 20 mL TB 배지에 접종하여 600 nm에서의 광학 밀도(OD600)가 약 0.05가 되도록 합니다.

세포의 OD 600이 약 0.35에서 0.45가 되었을 때, 32 °C에서 진탕 배양하십시오. 저속 원심분리를 통해 세포를 수확한 후, 채널 중앙에서 예상되는 농도의 화학 유인 물질(chemo effector)이 포함된 CB에 세포를 재현탁하여 OD 600이 약 0.35가 되도록 맞춥니다. 마지막으로, GFP를 발현하는 살아있는 세포에 OD 600이 약 0.35인 RFP 표지 사멸 세포를 추가합니다.

이 사멸 세포들은 이동이 유동 효과로 인한 것이 아님을 확인하기 위한 내부 대조군으로 사용됩니다. 이제 세포 현탁액을 화학주성 실험을 위해 미세유체 장치에 주입할 준비가 되었습니다. 화학주성 실험을 시작하려면, 세포 주입구 바늘 허브에서 CB의 일부를 제거하고 세포 현탁액으로 채우십시오.

부유시킨 세포를 50 µL 시린지에 조심스럽게 채웁니다. 편모가 전단되어 운동성이 감소할 수 있으므로 이 과정은 천천히 수행하십시오. 시린지 내용물을 소량 밀어내어 그 방울을 니들 허브의 액체에 접촉시킨 후 시린지를 연결하는 방식으로, 앞서 보여드린 것과 같이 50 µL 시린지를 입구 니들 허브에 부착합니다. 그 다음 이미지 획득을 위한 고속 카메라가 장착된 형광 현미경의 스테이지 위에 장치를 배치합니다.

두 개의 입구 시린지를 시린지 펌프에 장착하고, 그래디언트가 형성되어 세포가 튜브를 통해 흐르도록 유량을 시작합니다. 세포가 화학주성 챔버에 진입하면 시스템이 안정화될 때까지 약 20분 동안 기다립니다. 이미징을 수행하기 전, 챔버 길이를 따라 서로 다른 위치에서 생존 세포(녹색)와 사멸 세포(적색)의 형광 이미지를 수집합니다.

일반적으로 각 위치에서 3초 간격으로 100장의 이미지를 수집합니다. 획득한 형광 이미지는 Image J 또는 metamorph와 같이 상업적으로 이용 가능한 이미지 분석 프로그램이나 MATLAB으로 작성된 간단한 코드를 사용하여 분석할 수 있습니다. 본 예시에서는 MATLAB 코드를 사용하겠습니다.

설정된 임계값 픽셀 강도를 통해 이미지의 배경 픽셀을 제거하고, 임계값보다 강도가 낮은 모든 픽셀을 제거하는 것으로 시작하십시오. 이는 노이즈를 최소화합니다. 분석 시에는 사멸한 세포의 위치를 사용하여 이미지의 중심을 결정하십시오.

이는 세포가 화학주성 챔버로 진입한 위치이자, 이동이 없을 때 세포가 검출될 위치를 나타냅니다. 다음으로, 이미지에서 살아있는 세포를 찾아 이미지를 채널로 나누고 각 채널 내의 살아있는 세포 수를 결정합니다. 이전 연구에서 10 50 µm 너비의 화학주성 챔버를 각각 약 16 µm 너비의 64개 채널로 나누었습니다.

모든 이미지에 대해 이 단계들을 반복한 후, 모든 이미지에 걸쳐 각 채널의 전체 세포 수를 합산합니다. 이를 통해 실험 기간 동안 각 채널에서 검출된 총 세포 수를 구할 수 있습니다. 이동 방향을 나타내는 화학주성 분배 계수(chemo taxes partition coefficient) 또는 CPC를 계산하십시오.

다음 단계들을 수행하여, 사멸된 세포의 고농도(우측) 영역에 위치한 각 세포에는 +1의 곱셈 인자를, 저농도(좌측) 영역에 위치한 각 세포에는 -1의 곱셈 인자를 각각 할당합니다. 모든 곱해진 값들을 합산한 후, 검출된 전체 세포 수로 나누어 정규화합니다. 이를 통해 세포가 이동한 거리에 따라 세포 이동 가중치를 산출하는 화학주성 이동 계수(chemo taxes, migration coefficient 또는 CMC)를 계산합니다.

가장 높은 농도 위치인 채널 64로 이동하는 세포에는 가중치 계수 +1을 부여하고, 고농도 쪽으로 절반 정도 이동한 세포에는 가중치 계수 +0.5를 부여하며, 가장 낮은 농도 위치로 이동하는 세포에는 가중치 -1을 부여합니다. 모든 가중 세포 수의 합계를 구한 후 이를 세포 수로 정규화하여 CMC를 산출합니다.

이 그래프는 플루오레세인 이소티오시아네이트를 사용하여 미세유체 장치 내에 형성된 선형 농도 구배 또는 프로파일을 보여줍니다. 이 그림에서는 청색과 황색 색소를 사용하여 농도 구배의 형성을 입증하였습니다. 세포 입구는 CA로 설정하여 흐름이 없도록 하였으며, 그 결과 청색과 황색 사이의 다양한 색상 범위가 형성된 것을 확인할 수 있습니다.

여기 e coli RP 4 37을 장치 내의 0에서 100 µM L aspartate 또는 0에서 225 µM nickel sulfate 농도 구배에 노출시킨 대표적인 화학성 분석 실험의 가색 이미지들이 있습니다. L aspartate를 향해 또는 nickel로부터 멀어지는 살아있는 녹색 박테리아의 이동을 30분 동안 2.5초 간격으로 촬영하였습니다. 빨간색으로 표시된 죽은 박테리아는 장치 내 유동 효과에 대한 대조군으로 사용되었습니다.

구배가 없는 상태에서 마이크로유체 장치 내 RP 4 37의 공간적 분포를 아스파르테이트 구배 및 황산니켈 구배에 대한 반응과 비교하여 이 그래프에 나타내었습니다. 지금까지 황산니켈 구배에서 e coli RP 4 37의 화학성(chemotaxis)을 모니터링하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 높은 운동성을 가진 하위 집단을 활용할 수 있도록 세포의 볼텍싱(vortexing)을 최소화하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.