세포 생물학을위한 그라디언트 생성 Microfluidic 장치

제 이름은 Jiang이며, 하버드 및 MIT 보건 과학 기술 대학의 포스터 펠로우입니다. 그리고 제 이름은 Amir Manchi이며, 하버드 및 MIT 보건 과학 기술 학부의 ha SANE 교수 연구실 학부생입니다.

이 슬라이드는 장치 제작의 모식도를 보여줍니다. 먼저 실리콘 웨이퍼 위에 SUA 50을 스핀 코팅한 후, 실리콘 웨이퍼 위에 마스크를 배치하고 UV 노광 및 현상을 진행합니다. 이를 통해 최종적으로 실리콘 웨이퍼 위에 패드를 형성할 수 있습니다. 그 다음 PDMS를 캐스팅하여 경화 및 베이킹 과정을 거친 뒤, 작은 구멍을 뚫어줍니다. 마지막으로 산소 플라즈마를 사용하여 PDMS 장치와 유리 기판 사이를 본딩하여 장치를 완성합니다.

이제 실험실 내의 마이크로 제작실에 들어왔으며, PDMS 층을 만드는 것부터 시작하겠습니다. 여기서 PDMS란 과학적 정식 명칭으로 폴리디메틸실록산(polymethyl siloxane)을 의미하며, 이는 유기 고분자입니다. 이는 가장 널리 사용되는 실리콘 기반 유기 고분자입니다.

이는 실제로 두 가지 서로 다른 물질의 혼합물로, 실리콘 엘라스토머 베이스와 실리콘 엘라스토머 경화제의 혼합물입니다. 혼합 비율은 베이스 10 대 경화제 1입니다. 베이스 약 10 g이 필요하므로, 이에 따라 엘라스토머 경화제 약 1 g이 필요하며, 이 베이스와 경화제가 서로 잘 섞이도록 혼합하겠습니다.

피펫을 사용하겠습니다. 혼합물이 준비되었으므로, 이제 이를 실리콘 웨이퍼 위에 붓겠습니다. 이 실리콘 웨이퍼의 상단에는 특정 패턴이 형성되어 있습니다.

이것들은 실제로 PDMS 폴리머가 패턴을 형성하도록 도와주며, 우리는 이 패턴들을 이용하여 폴리머 위에 필요한 채널, 홈 또는 기타 임의의 패턴을 만듭니다. 다음 단계는 혼합물 내부에 많은 기포가 있으므로, 폴리머 내부의 기포를 제거하기 위해 진공 상태에 두는 것입니다. 진공 챔버 내의 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS 겔을 배치하겠습니다.

이제 챔버를 닫고 진공 상태로 만들겠습니다. 기포가 모두 사라질 때까지 약 몇 분 정도 기다린 후, 70 °C로 설정된 오븐에 넣고 하룻밤 동안 굳힙니다. 주목해서 보셔야 할 패턴은 경사 농도를 만들기 위한 세 개의 서로 다른 저장소입니다. 이를 통해 한쪽은 농도가 0이 되고, 반대쪽은 특정 농도가 되도록 하여 농도가 균일하게 변하도록 설정할 것입니다. 그리고 반대쪽 끝에 작은 구멍을 뚫어 이번 실험의 배출구로 사용하겠습니다.

다음 단계는 이러한 패턴 중 하나를 잘라 패턴 표면이 위로 향하게 하여 페트리 접시에 옮기는 것입니다. 이 패턴에서 앞서 설명해 드린 3개의 입구와 1개의 출구를 확인하실 수 있을 것입니다. 폴리에틸렌 튜빙을 사용할 수 있도록 입구에는 작은 펀치를 사용하고, 리저버(reserve war)를 만들기 위해 출구에는 큰 펀치를 사용하겠습니다.

먼저 첫 번째 입구부터 시작하겠습니다. 첫 번째와 마찬가지로 두 번째 입구에 펀칭을 하고, 세 번째 입구에는 작은 펀칭을 하나 더 하겠습니다. 마지막 단계로 출구 부분에 큰 펀칭을 합니다.

작업이 완료되면 최상층으로 APDMS 층이 형성되며, 하단에는 또 다른 유리 층을 사용할 것입니다. 이 마이크로 슬라이드가 마이크로 유체 소자의 바닥 층이 됩니다. 현재 마이크로 제작실에 있으며, 유리 한 장과 PDMS 층 하나를 서로 접합하려고 합니다.

이제 사용할 장비는 플라스마 세척기(plasma cleaner)입니다. 챔버 내부에서 플라스마는 취약한 표면 결합을 분해하고 이를 반응성이 높은 화학 그룹으로 대체하며, 결과적으로 표면을 친수성으로 변화시킵니다. 이제 내부 채널이 형성된 상단 층인 PDMS 몰드를 가져와, 몰드에 먼지가 붙는 것을 방지하기 위해 미리 붙여두었던 테이프를 제거하겠습니다.

이를 챔버 내부에 배치하겠습니다. 다음 단계로, 현미경 슬라이드인 유리층을 준비했으며, 이것이 장치 내부의 바닥층이 될 것입니다. 따라서 이 슬라이드 역시 챔버 내부에 배치하겠습니다.

챔버를 완전히 닫은 후, 먼저 전원을 켜고 그다음에 펌프를 켭니다. 약 5분 후에 다시 이 장치로 돌아와야 합니다. 이제 장치를 끌 예정입니다. 먼저 펌프를 끄고 다음으로 전원을 끈 뒤 챔버를 엽니다.

이 소리는 실제로 챔버 내부의 공정 중에 가해진 음압으로 인해 발생하는 것입니다. 이제 각 층을 꺼내어 서로 결합시키겠습니다. 유리가 바닥층이므로 왼손으로 잡고 고정한 뒤, PDMS 층을 집어 유리 층 위에 올리겠습니다.

하지만 현재 패턴이 위를 향하고 있으므로, PDMS 층을 뒤집겠습니다. 두 층을 함께 누른 후 유리 위에 배치하겠습니다. 매우 쉽게 부착되며, 이러한 플라스마 처리 공정의 장점 중 하나는 접착 강도와 영구성에 있습니다.

최종 모습은 이와 같습니다. 다시 한번 말씀드리면, 이곳이 유입구들이고 이쪽이 유출구이며, 이제 다음 단계로 넘어갈 준비가 되었습니다. 장치 내부에서 섬유화 과정을 진행한 후, 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후 1시간 뒤에 인큐베이터에서 샘플을 꺼내어 세포 배양 배지를 넣고 용액을 조제합니다.

EGF 용액을 제조하기 위해, 2 mL의 배양 배지에 15 ng/mL의 EGF와 10 µM의 DMSO를 첨가하였습니다. 이 용액은 채널 전체에 걸쳐 EGF 구배를 시각화하는 데 사용됩니다. 그런 다음, 2 mL의 배양 배지를 취해 이곳에 넣고, 다시 다른 2 mL의 배양 배지를 추가합니다. 이 두 설정은 장치 내에 일반 배양액을 주입하는 일반 배양 과정입니다.

기포를 제거하고 다시 연결했는데, 여기에서도 또 기포가 발생합니다. 그런 다음 15 ng의 EGF와 10 µM의 FITC-dextran, 그리고 샘플 2에서 가져온 2 mL의 배지를 사용하여 시린지를 장착하고 기포를 제거합니다. 그 후 솔루션 스위칭을 수행하고 다시 원래대로 되돌립니다.

용액을 가스 타입 시린지에 넣고, 기포를 제거하기 위해 SH를 여러 번 누릅니다. 모든 시린지의 용액이 이곳으로 먼저 들어오게 한 뒤, 3방향 밸브를 전환하여 용액이 튜브를 통해 나오게 합니다. 혼합 후 용액이 나오면, 튜브를 My Predict 장치에 삽입합니다. 세 가지 용액 모두 동일한 방식으로 주입 채널의 입구에 조심스럽게 연결하면 됩니다.

최종적으로 하나는 일반 배양 배지이고, 다른 하나는 EGF가 포함된 배양 배지로, EGF의 농도 구배 프로필을 확인하기 위한 것입니다. 이것은 cell-in-net, 즉 네트 내의 세포입니다.

여기가 세포 배출구이며, 3개의 허브 채널을 사용하여 구배를 형성한 다음 세포 영역 내부에 구배를 생성합니다. 일반적으로 제가 수행하는 방식은 세포 현탁액을 배출구에 배치한 다음, 가볍게 흡입하여 세포가 세포 영역으로 자동적으로 흘러 들어가 안착하게 하는 것입니다. 그 다음 코팅된 표면에 세포가 완전히 퍼졌는지 확인합니다. 세포가 완전히 퍼진 것을 확인한 후, 주입을 시작하여 구배 생성 장치를 이용해 세포 이동을 연구할 수 있습니다.