Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

이 영상은 Styro Dye FM 1 43의 광전환 절차를 보여줍니다. drosophila melanogaster의 시냅스 소포 풀을 연구하기 위해, 먼저 초파리 유충을 해부하여 신경근 접합부(NMJ) 표본을 구성하는 복측 근육을 노출시킵니다. 준비된 표본을 FM D가 포함된 버퍼에서 배양하며, 여기에서 회색으로 표시된 부분이 세포막에 라벨링된 모습입니다.

그 후, 물리적 융합을 유도하기 위해 전기적 또는 화학적 자극을 가하며, 뒤이어 소낭 막이 내입됩니다. 자극된 엑소사이토시스는 FM D로 염색됩니다. 그 다음 세포외 FM 염료를 세척하여 세포막에서 제거하고, 지속적인 고강도 조명 하에서 조직을 고정합니다. 염료는 완전히 탈색되며, di amino Ben 침전으로 인해 검은색이 나타납니다.

이 침전물은 투과 전자 현미경(TEM)으로 시각화할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 독일 괴팅겐에 있는 유럽 신경과학 연구소의 Sylvia Olli 연구실 소속 Philippe o Paso입니다. 오늘은 신경근 접합부 내에서 FM 광전환을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 시냅스 소포 재순환을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 해부 현미경 하에서 작업을 수행합니다. 먼저 소 가드(so guard)가 코팅된 디시에 초파리 유충을 등 쪽이 위로 오게 하여 핀으로 고정합니다.

주사기 바늘을 사용하여 초파리 식염수로 덮고, 해부 가위로 등쪽을 세로로 절개하십시오. 그런 다음 내부 장기를 제거하십시오. 다음으로, 시료를 펼친 후 다시 시가 접시에 핀으로 고정하십시오.

그 다음, 몇 개의 복측 근육을 이용하여 이 절차에 사용되는 FM 염료가 퇴색되지 않도록 보호할 수 있습니다. 이 절차는 저조도 환경에서 수행해야 합니다. 집게로 고정한 초파리 표본을 90 millimolar potassium chloride와 10 micromolar FM.1 43이 포함된 초파리 식염수로 덮어 신경을 화학적으로 자극하십시오.

자극 후 실온에서 1분 동안 배양합니다. 자극 용액을 제거하고, 화학 안전 후드 내에서 100 milliliters의 초파리 식염수로 채워진 비커에 핀으로 고정된 초파리가 담긴 접시를 두 번 담가 세포 외 FM 1 43 염료를 제거합니다.

신경근 접합부 준비물을 인산 완충 식염수(PBS) 내 2.5% glutaraldehyde에 넣고 상온에서 45분 동안 고정합니다. 준비물을 PBS로 한 번 세척한 후, 시가 접시(cigar dish)에서 꺼내 100 millimolar ammonium chloride에 15분 동안 담급니다. 이는 남아 있는 glutaraldehyde 고정제의 유리 알데하이드기를 퀀칭(quench)하기 위함입니다.

일반 PBS를 사용하여 염화암모늄 용액을 세척하고, 신경근 접합부 표본을 새 시가 접시(cigar dish)로 옮긴 후 필터링된 1.5 mg/mL의 Diamine benzidine 또는 DAB/PBS 용액에 담가 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. 백미러가 포함된 램프 하우징과 수은 램프 광원이 장착된 형광 현미경 아래에 샘플을 배치하고, 상대적으로 저배율의 건식 대물렌즈를 사용합니다.

시료를 찾습니다. 그런 다음 일반적인 청색 여기-녹색 형광 필터 큐브를 사용하여 형광 신호의 초점을 맞춥니다. 신경근 접합부는 근육 상의 밝은 점으로 나타납니다.

다음으로, 동일한 형광 필터 세트를 사용하여 FM D가 완전히 퇴색될 때까지 최대 강도로 시료를 조사합니다. 20배 대물렌즈를 사용하는 경우 30분에서 45분이면 충분할 것입니다. 하지만 광전환 시간은 조사 강도, 표본 내 DAB의 침투 강도 및 사용되는 대물렌즈에 따라 달라집니다.

조사 후 투과광 하에서 시료를 관찰합니다. 광전환이 일어났다면 짙은 갈색 침전물이 보여야 합니다. 다시 해부 현미경으로 돌아가 가위로 유충에서 광전환된 부위를 절단합니다.

해부 현미경으로 돌아갑니다. 그런 다음 가위를 사용하여 유충에서 광전환된 부위를 절단합니다. 이제 장갑과 보안경을 포함한 적절한 안전 장비를 착용하고 화학 안전 후드 아래에서 작업하며, 샘플을 PBS가 담긴 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.

시료당 1% 사산화오스뮴 용액 300 µL를 준비합니다. 이제 시료를 플라스틱 캡이 달린 유리 플라스크에 넣고, 준비된 사산화오스뮴 용액을 첨가하여 고정 과정을 수행합니다. 시료를 배양하는 동안 30%, 50%, 70%, 90%, 95% 및 100% 농도의 에탄올 용액을 각각 따로 준비합니다.

PBS로 샘플을 5분씩 4~5회 세척합니다. 매 세척 후에는 피펫에 플라스틱 PE 팁을 장착하여 샘플을 새 플라스크로 옮깁니다. 마지막 세척 후에는 샘플을 깨끗한 유리 플라스크로 옮깁니다.

다음으로, 시료를 일련의 에탄올 용액에 넣어 탈수시킵니다. 우선 30% ethanol 1 mL에서 배양합니다. 5분 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 에탄올을 제거하고 50% ethanol 1 mL로 교체합니다.

신경근 접합부 표본을 70%, 90%, 그리고 95% 용액 순으로 배양하여 탈수 과정을 계속합니다. 그 다음, 표본을 95% 에탄올 용액에 배양하고, 탈수 후 100% 에탄올에 세 번 배양합니다. 1:1 비율의 EIN 수지를 에탄올에 2 mL 첨가하고 표본을 회전 배양기에 넣습니다.

100% EIN에서 회전시킨 후 실온에서 2~4시간 동안 유지하고, 샘플을 오픈 플라스크에 넣어 남은 에탄올이 4~6시간 동안 증발하도록 합니다. 신선한 EIN을 몰드에 붓습니다. 준비물을 넣고 60 °C에서 36시간 동안 배양합니다.

EIN 임베딩 시료가 준비되면, 다이아몬드 나이프가 장착된 초박절단기(ultra microtome)를 사용하여 50 내지 80 nanometer 두께의 박절편을 제작합니다. 시료를 얇은 절편으로 절단합니다. 절단된 절편은 나이프의 워터 배스(water bath) 위로 흘러나오며, 이후 일반적인 EM 그리드로 수집할 수 있습니다.

이제 일반적인 EM 절차를 사용하여 이미징할 준비가 되었습니다. Drosophila melanogaster에서 분리한 신경근 접합부를 고농도 칼륨으로 자극하였으며, 내재화된 막은 여기에서 보여주는 바와 같이 FM 1 43으로 염색되었습니다.

신경 말단의 형광은 일반적인 에피 형광 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다. 연속 조명 하에서 염료는 완전히 표백되며, 조명이 계속되면 디노벤진 침전으로 인해 검은색이 나타납니다. 이 신경 말단은 시냅스 소포를 포함하고 있으나, 그 중 어느 것도 광전환되지 않습니다.

이는 조명이 부족하거나 조직 내 DIA amino benzine 침투가 원활하지 않아 발생할 수 있습니다. 반대로, 조명이 너무 강하면 전체적으로 터미널이 어둡게 나타나 소포나 소기관을 구별할 수 없게 됩니다. 적절한 양의 조명을 사용하면 광전환(photo conversion)을 확인할 수 있습니다. 이 현미경 사진은 어두운 소포 군집이 보이는 시냅스 버튼(synaptic bhuton)을 보여주며, 이는 FM 광전환이 일어났음을 나타냅니다.

지금까지 fem dye로 표지된 시냅스 소포를 광전환하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 전환 단계의 조사 시간을 항상 주의 깊게 보정하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.