의 시냅틱 변조 분석

본 실험 절차의 전반적인 목적은 서로 다른 활성화 조건 하에서 단일 뉴런의 시냅스 동역학을 이해하는 것입니다. 이 방법은 뉴런 활성의 성숙에 따른 시냅스의 분자 조성 변화를 밝히는 것과 같이 시냅스 가소성 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시냅스의 수, 분포, 그리고 시냅스 후 분자 성분의 농축 수준을 포함한 시냅스의 다양한 측면을 반자동으로 분석할 수 있다는 점입니다.

본 실험을 위해, 우화 후 6시간 이내에 파리들을 일반 바이알에 수집하십시오. 수집된 바이알을 투명 아크릴 랙에 넣습니다. 25 °C로 설정된 소형 인큐베이터 내에서, 빛 노출량이 평균 1000 lux가 되는 LED 패널로부터 정확한 거리에 랙을 배치하십시오.

그런 다음, 지속적인 암흑, 12시간 명기/12시간 암기, 또는 지속적인 명기의 조건 중 하나를 선택하여 초파리를 1~3일 동안 사육합니다. 이후 표준 기술을 사용하여 뇌를 적출하고 염색합니다. 초파리 뇌를 마운팅하려면, 마이크로피펫에 마운팅 용액을 채운 뒤 현미경 슬라이드 중앙에 2 µL 방울 두 개를 약 2 cm 간격으로 떨어뜨립니다.

각 방울 위에 커버슬립을 덮고 틈새를 약 0.2 mm 정도로 유지합니다. 그다음 커버슬립 위와 틈새 사이로 15 µL의 마운팅 용액을 넣습니다. 해부 현미경 하에서 마이크로피펫을 사용하여 뇌 조직을 틈새 안으로 옮깁니다.

그런 다음 뇌의 복측 면이 위로 오도록 배치합니다. 마지막으로 커버슬립을 덮고 투명 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉합니다. 이후 표준 기술을 사용하여 뇌를 촬영함으로써 3D 이미지를 재구성할 수 있습니다.

본 사례에서는 star 방법을 사용하여 Brp 발현이 활발한 세포에서 GFP 발광을 기록하였습니다. 또한, 이 예시에서는 R7 및 R8 광수용기 축삭을 anticiaoptin으로 면역 표지하였으며, 이는 RFP가 표지된 2차 항체를 사용하여 관찰하였습니다. Brp GFP puncta의 수, 분포 및 탈국소화 수준을 정량화하려면, 먼저 이미지 스택으로 제작된 뇌의 재구성된 3D 이미지를 불러옵니다.

Brp puncta가 흰색으로 표시됩니다. 이제 관심 영역을 찾습니다. 이 경우, M3 medulla 층으로 진입하는 지점에서 anticiaoptin 양성 축삭이 가늘어지는 경로를 따라 R8 axon의 말단을 찾을 수 있습니다.

각 R8 축삭 말단에서 스폿 검출 모듈을 사용하여 Brp GFP 펑타(puncta)를 식별합니다. 'add new spots'를 선택한 다음, 알고리즘 설정에서 'segment only region of interest'를 선택합니다. 분석 영역이 정의되면 소스 채널을 Brp GFP로 설정하고, 예상 XY 직경을 0.35 microns로 설정합니다.

그다음, 스팟 검출(spot detection)에서 배경 감산(background subtraction) 항목을 선택하십시오. 이어서 필터 유형으로 품질(quality)을 선택하면 펑크타(puncta)가 자동으로 필터링됩니다. 완료(finish)를 클릭하여 이 단계를 마무리하십시오.

데이터셋에 있는 모든 R8 axons에 대해 스팟 검출 방법을 반복합니다. 다음으로 식별할 영역은 axon cytoplasm입니다. 먼저, surface 함수를 사용하여 표면 객체를 생성합니다.

그런 다음, 새로운 표면 추가(add new surfaces)를 선택하고, 알고리즘 설정에서 관심 영역만 분할(segment only region of interest) 옵션을 활성화하십시오. 이제 관심 영역을 수동으로 선택하십시오. 다음으로, 계산 매개변수를 설정하십시오.

광수용체 채널을 소스로 찾으려면 smooth 옵션을 선택하십시오. 임계값으로는 absolute intensity를 선택하십시오. split touching objects 옵션을 활성화하십시오.

시트 포인트(seat points) 직경을 0.5 µm로 설정하고, 품질 및 복셀 수에 대한 기본 필터 설정을 사용하십시오. 그러면 필터가 자동으로 적용됩니다. 이제 편집(edit) 메뉴로 이동하여 관심 영역(region of interest) 외부에 생성된 표면 조각들을 삭제하십시오.

이 경우에는 다른 축삭들에 대해서도 동일하게 적용합니다. 데이터셋의 모든 R8 축삭에 대해 축삭 영역 검출을 반복한 후, 모든 Brp puncta와 R8 축삭은 스팟 객체(spot objects) 세트로 식별됩니다. 그리고 이에 대응하는 세포질 영역은 표면 객체(surface objects)로 식별됩니다.

이제 각 축삭의 방향과 공간을 수동으로 정의하십시오. 이는 나중에 medulla neuropil 내의 각 뉴런을 따라 Brp GFP 밀도를 정량화하는 데 중요합니다. 이를 위해 먼저 각 축삭의 시작점과 끝점을 정의하십시오.

'새 측정점 추가'를 선택한 다음, '편집'을 선택하고 이어서 '객체 표면 선택'을 선택하여 표면 객체의 상단부 작업을 수행합니다. 시작점을 정의하려면 M1 층의 R 축삭(axons)에 있는 모든 표면 객체에 측정점을 배치하십시오. 이 점들은 체계적이고 재현 가능한 순서로 배치해야 합니다.

다음으로, 끝점들을 정의합니다. '새 측정 지점 추가(add new measurement points)', '편집(edit)', 그리고 다시 '객체 표면(surface of object)'을 선택하십시오. 그 다음, 동일한 체계적 순서를 반복하여 M3 층에 있는 R axons의 바닥 부분에 측정 지점들을 배치하십시오.

Brp 배경 강도를 정량화하려면 두 R7 축삭의 세포질 영역을 분석하십시오. '새 표면 추가(add new surfaces)'를 선택하고, R8 축삭에서 수행한 것과 동일하게 R7 축삭 영역을 수동으로 정의하십시오. '접촉하는 객체 분할 활성화(enable split touching objects)' 옵션을 켜지 않는 것 외에는 동일한 설정을 사용하십시오.

이 설정은 끕니다. 다음으로, 정의된 R7 axon 영역 내에 더미 spots 객체를 추가합니다. 'add new spots'를 선택하고, 'skip automatic creation'을 선택한 후 수동으로 편집합니다.

그 다음, 객체의 중심을 선택하고 표면 객체를 클릭하여 R7 축삭 내부에 더미 스팟 객체를 배치합니다. 이제 두 번째 R7 축삭에 대해 표면 및 스팟 검출 단계를 반복합니다. 그런 다음 R8 축삭에서 했던 것과 같이 R7 축삭의 시작 및 종료 말단 지점을 정의합니다.

이 분석을 위해 올바른 소프트웨어가 설치되어 있는지 확인하십시오. 스팟 데이터, 표면 데이터, 그리고 동일한 수의 측정 지점을 포함하는 두 개의 측정 지점 객체가 포함된 데이터셋을 엽니다. 데이터를 점검하십시오.

계산이 정상적으로 작동하려면 두 측정 지점 객체의 측정 지점 수가 동일해야 합니다. 스팟, 축삭 영역, 시작점 및 종료점이 모두 정의되면 플러그인을 시작하십시오. 먼저 메타데이터, 특히 복셀 크기를 확인하십시오.

편집 메뉴에서 이미지 속성을 열고, 기하학(geometry)의 좌표(coordinates) 항목에서 복셀(voxel)의 3차원 크기와 마이크론(microns) 수치를 확인하십시오. 다음으로, 강도 분석을 수행할 채널을 선택합니다. 본 사례에서는 Brp GFP가 나타나는 채널을 선택하였습니다.

그런 다음 결과 파일 이름을 정의합니다. 다음으로 빈(bin) 수를 10으로 정의하고, 축삭 길이를 100%로 설정합니다. 그 후 스팟 반경을 0.35 microns로, 주변 세포질 영역을 50 microns로 설정하여 펑타(puncta) 영역을 정의합니다. 마지막으로 시냅스 검출 명령을 실행하고, 이후 출력 결과에 대해 통계 분석을 수행합니다.

설명된 프로토콜에 따라, 지속적인 암흑, 지속적인 빛 또는 정상적인 명암 주기에 노출된 초파리의 R8 시냅스에서 Brp GFP puncta를 분석하였습니다. 지속적인 빛 조건에서 유지된 초파리의 R8 광수용체에서 Brp puncta의 수가 유의미하게 감소하였습니다. puncta의 분포는 커스텀 플러그인을 사용하여 계산하였습니다.

R8 시냅스는 M1에서 M3 층까지의 축삭 전 구간에 분포되어 있었으나, 그 밀도는 M1 및 M3 층에서 더 높았습니다. 마찬가지로 펑크타(puncta)의 탈국소화 수준을 계산하였습니다. 모든 조건에서 탈국소화 수준은 변하지 않았으나, Brp GFP의 탈국소화 수준은 지속적인 빛 조사 하에서 명확하게 확산되는 Brp-short-cherry와 같은 다른 리포터들과는 차이가 있었습니다.

AZ에서 분리된 후 Brp 짧은 단편(short fragment)에 부적절한 가공이 일어났을 가능성이 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단일 뉴런에서 시냅스 가소성 특성을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 가소성 특성에는 시냅스 수, 시냅스의 분포, 그리고 시냅스 형성 후 특정 분자 성분의 농축 표지가 포함됩니다.