에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

후각 상피 표본을 디쉬에 고정하고 가습된 공기 흐름 속에 배치합니다. 해부 현미경 하에서, 완충 용액을 통해 참조 전극을 조직에 전기적으로 연결합니다. 기록 전극을 후각 상피 표면에 배치합니다.

후각 상피는 가습된 공기 흐름 속에 투입되어 후각 상피로 전달되는, 컴퓨터로 제어되는 취기 펄스(odorant puffs)에 의해 자극됩니다. EOG 신호는 증폭기와 디지털 변환기를 거쳐 기록용 컴퓨터로 전송됩니다. 안녕하세요, 저는 존스 홉킨스 대학교 생물학과 Hygiene XO 연구실의 Catherine Ciar입니다.

오늘은 마우스의 전기 후각도(electro-olfactogram)를 기록하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 후각 감각 뉴런의 냄새 반응을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

기록 장치는 기록 전극, 기준 전극, 공기 공급관, 시료 스테이지, 그리고 해부 현미경으로 구성되며, 이 모든 장치는 패러데이 케이지 내의 에어 테이블에 고정되어 있습니다. 공기 공급관 내에 전극을 배치하기 위해 마이크로 조작기를 사용합니다. 연속적인 공기 흐름을 증류수에 버블링하여 습도를 더한 후, 공기 공급관을 통해 시료 위로 통과시킵니다.

6~8mm 두께의 파라핀으로 채워진 60mm 배양 접시를 시편의 고정 표면으로 사용합니다. 고정 접시의 파라핀 부분에 웰(well)과 채널을 파냅니다. 이는 수정된 링거액(ringer solution)을 통해 기준 전극을 시편에 전기적으로 연결하기 위한 수단을 제공하기 위함입니다.

기록 전극과 기준 전극은 증폭기에 연결됩니다. 증폭기에서 나온 신호는 디지타이저를 거쳐 컴퓨터로 전송됩니다. 자극 프로토콜 제어, 신호 기록 및 반응 분석을 위해 XI graph 소프트웨어가 사용됩니다.

기록 전극을 배치하는 동안과 EOG 기록 중에 전기 전위를 실시간으로 모니터링하기 위해 증폭기 뒤에 오실로스코프를 연결합니다. 향 자극의 제공은 피코 스프리처(pico spritzer)로 제어하며, 이는 향 자극을 제공하기 직전에 신호 획득에 사용되는 것과 동일한 컴퓨터에 연결됩니다.

pico spritzer 출력단은 액체 후각 자극제가 들어 있는 후각 자극제 병에 연결됩니다. 그다음 이 병은 공기 공급 튜브에 연결됩니다. 이제 기록 실험을 위한 전극 준비 방법을 살펴보겠습니다.

기록 전극은 변형된 링거액(ringer solution)이 채워진 당긴 유리 모세관 안의 염화은 도선입니다. 기준 전극은 염화은 도선입니다. 전극 홀더에 은선을 설치하여 두 전극의 준비를 시작하십시오.

기록 전극의 경우, 전극 홀더 끝단에서 전선이 1~2cm 정도 돌출되어야 합니다. 기준 전극에는 전선을 더 길게 남겨두어도 좋습니다. 염화은 코팅을 입히려면 전선을 0.1 M 염화나트륨 용액에 넣고 전극 홀더를 1.5~9V DC 전원의 양극 단자에 연결하십시오.

전원의 음극은 0.1 molar 염화나트륨 용액에 전기적으로 연결되어야 합니다. 기록 전극과 기준 전극 사이의 정전하를 균등하게 하기 위해 염화 반응이 10분 동안 진행되도록 둡니다. 전극을 기록 장치에 설치하기 전에 전극끼리 짧게 접촉시킵니다.

다음으로, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 뽑아냅니다. 모세관 팁의 개구부 직경은 약 5~10 µm가 되어야 합니다. 다이아몬드 펜슬을 사용하여 모세관의 뭉툭한 끝부분에 금을 그어 부러뜨려, 은선의 길이보다 약 2 cm 더 길게 만듭니다.

부탄 토치를 사용하여 절단된 끝부분을 화염 연마(fire polish)한 다음, 수정된 링거 용액(modified ringer solution)에 0.5% agros를 녹입니다. 가열 후 길고 가늘게 뽑아낸 시린지를 사용하여, 전극 끝부분에 소량의 용융된 agro 용액을 옮겨 담기 위해 트랜스퍼 피펫을 사용합니다. 뽑아낸 모세관의 약 절반 정도를 채웁니다.

변형된 링거액을 사용하여 모세관을 가볍게 튕겨 기포를 제거합니다. 충전된 전극은 사용 직전까지 바닥에 변형된 링거액이 소량 들어 있는 보관 용기에 넣어 보관하십시오. 조직 샘플이 준비되어 기록이 가능한 상태가 되면, 전극이 준비된 상태에서 충전된 모세관을 기록 전극 와이어 위에 설치합니다.

기록 준비를 위한 조직 준비 기록 실험을 살펴보겠습니다. 희생된 마우스의 두개골 위 피부를 제거하고 머리를 정중선을 따라 양측으로 이등분한 후, 머리의 절반을 내측이 위로 향하게 하여 마운팅 디쉬에 고정합니다. 비갑개가 노출되도록 비중격을 조심스럽게 제거합니다.

조직이 고정된 디쉬를 기록 스테이지 위에 놓습니다. 비갑개의 기록 위치가 현미경 중앙에 오도록 스테이지를 정렬합니다. 이제 에어 탱크를 켜서 비갑개 표면에 분당 약 600 milliliters의 가습 공기를 공급합니다.

공기 주입 튜브를 기록 위치에서 약 10 millimeters 떨어진 곳에 배치합니다. AC 증폭은 EOG 신호에 아티팩트를 유발하므로 증폭기를 DC 모드로 설정하십시오. 저역 통과 필터 1 kilohertz 및 이득 100 x로 데이터를 획득합니다.

이제 기록 전극과 기준 전극을 마이크로 조작기에 장착하십시오. 기준 전극을 장착 디쉬의 웰 안으로 내려 조직과 전기적으로 연결되도록 수정된 링거액으로 덮어줍니다. 기록 전극을 비갑개 2B 또는 3의 표면 위로 조심스럽게 내리십시오.

전극이 후각 상피 표면에 살짝 닿아야 합니다. 전극이 상피와 접촉하면 오실로스코프에 직선의 기선(baseline)이 나타납니다. 이제 컴퓨터에 연결된 공기 공급 튜브의 측면 포트에 향료 병을 부착하십시오.

자극 프로토콜을 시작합니다. 데이터 수집을 위한 샘플링 속도는 2 kHz 이상이어야 합니다. 소프트웨어가 냄새 펄스를 트리거하고 기록을 시작합니다.

전형적인 자극 프로토콜은 100 millisecond 지속 시간의 단일 펄스 쌍, 1 second 간격으로 분리된 100 millisecond 펄스, 또는 10 second 지속 펄스로 구성될 수 있습니다. 적응 현상을 최소화하기 위해, 고농도의 취기(odor)를 전달한 후에는 프로토콜 사이에 1분에서 5분 정도의 간격을 둡니다. 튜브에 잔류 취기가 남아 있을 수 있으므로, 추가 조직 샘플로 진행하기 전에 공기 튜브를 95% ethanol로 세척하고 건조하십시오.

Axo graft 소프트웨어는 EOG 신호의 주요 파라미터를 측정하기 위한 도구를 제공합니다. 이러한 파라미터에는 반응 진폭, 잠복기, 피크 도달 시간 및 종결 시정수가 포함됩니다. EOG의 여러 파라미터, 특히 반응 진폭, 잠복기 상승 시간, 피크 도달 시간 및 종결 시정수는 마우스 간의 정규화된 반응을 비교하는 데 매우 유용합니다.

여기에는 액상 아밀 아세테이트의 농도를 높여 자극했을 때 마우스에서 나타난 OG가 제시되어 있습니다. 상단의 검은색 선은 취기 자극의 타이밍과 지속 시간을 나타냅니다. 여기서 다섯 마리 마우스의 평균값으로 도출된 용량-반응 관계를 확인할 수 있으며, 오차 막대는 95% 신뢰 구간입니다.

매우 높은 후각 농도에서는 피크 진폭의 감소가 흔히 관찰됩니다. 쌍펄스 자극에 대한 EOG의 예시가 나타나 있으며, 단일 단파장 후각 자극은 수 초 동안 지속되는 적응을 유발합니다. 여기 제시된 것은 10초 동안 지속된 후각 자극에 대한 EOG입니다.

EOG는 지속적인 후각 자극 제시 중에 탈감작 현상을 보여줍니다. 방금 생쥐로부터 전극도그램(electrode factor gram)을 기록하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 전극을 상피 표면에만 배치하고 표면 아래로 관통하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

변동성을 최소화하기 위해 항상 머리의 동일한 측면에서 기록하고 실험 설정을 변경하지 마십시오. 조직을 습윤하게 유지하되 액체 방울이 맺히지 않도록 주의하십시오. 해부 직후 조직을 가습된 공기 아래에 두면 기록을 위한 최적의 상태를 유지할 수 있습니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.