광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

본 실험의 전반적인 목표는 마우스를 마취하고 두개골을 노출시킨 후, 내재적 광학 신호(intrinsic optical signals)와 플라보단백질 자가형광 신호 또는 FAS 이미징을 사용하여 마우스 후각구 표면에서 후각으로 유도된 활동을 매핑하는 것입니다. 후각구 상단의 뼈를 얇게 깎아냅니다. 메스 날 끝을 사용하여 골편(bone flap)을 그린 후 이를 제거하며, 치과용 시멘트로 챔버를 만들어 노출된 후각구 표면을 둘러쌉니다.

이를 aros로 채우고 이 준비물 위에 커버 글라스를 덮습니다. 동일한 마우스에서 내인성 광학 신호와 FAS 이미징을 사용하여 후각 지도를 순차적으로 획득합니다. 광 반사 및 자가 형광 신호를 이용해 마우스 후각 구의 다른 유발 활동을 이미징하면 후각 구 내 사구체 배열의 공간적 코팅에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 2-deoxy glucose 이미징이나 fMRI와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 단일 사구체 수준의 공간 해상도로 사구체 유발 활동을 기록하는 것이 가능하다는 점입니다.

일반적으로 이러한 방법이 처음인 연구자는 외과적 기술과 기기 조작 기술을 습득하는 데 시간이 걸리기 때문에 작업 초기 단계에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 외과적 수술 및 영상 촬영 절차의 핵심 단계에 주의를 기울이게 하려면 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 마우스의 뒷발을 집어 마취 상태를 확인하고 클리퍼를 사용하여 두피의 털을 제거하십시오.

증류수에 적신 멸균 거즈 패드로 피부에 남은 털을 닦아냅니다. 주둥이가 머리 뒷부분과 동일한 평면에 오도록 마우스를 정위 고정틀(stereotaxic frame)에 배치합니다. 후각구(olfactory bulb)를 수평으로 위치시키기 위해, 움직임이 발생하지 않도록 귀 바와 코 바를 단단히 고정합니다.

영상 촬영 중 건조를 방지하기 위해 안구에 안연고를 도포한 후, 멸균 가위를 사용하여 Betadine으로 두피 부위를 소독합니다. 양 귀 사이의 머리 뒷부분에 절개를 가한 다음, 양쪽 귀 기저부 방향과 눈꺼풀을 따라 이마 방향의 전후 방향으로 절개합니다. 코 부분의 피부를 절개하여 두피 제거를 완료합니다.

노즈 바(nose bar)를 가이드로 사용합니다. 동물을 실체 현미경 아래에 위치시키고, 식염수에 적신 면봉을 사용하여 두개골 상단의 골막을 조심스럽게 분리합니다. 핀셋을 사용하여 남은 조직을 제거하고, 메스로 두개골 표면을 긁어내어 깨끗하게 준비함으로써 실험 내내 후구(olfactory bulb) 영역이 촉촉하게 유지되도록 합니다.

증류수에 적신 흡수성 젤라틴 스펀지 조각을 양 눈 사이에 위치한 후각구 상단의 뼈 위에 올립니다. 젤라틴 스펀지를 제거하고, 10번 메스 날을 사용하여 뼈를 부드럽게 긁어내기 시작합니다. 날과 뼈 사이의 각도를 45도로 일정하게 유지하며, 눈꺼풀에서 후각구 영역의 시상측 방향으로 날을 이동시킵니다.

골 삭제 과정에서 정맥동 상부의 뼈에 수직 압력을 가하거나 긁지 않도록 주의하십시오. 5분마다 작업을 중단하고 수분을 머금은 젤라틴 스펀지를 뼈 위에 올려 시편을 냉각시키십시오. 스펀지로 두개골을 닦아 뼈 가루와 먼지를 제거하고, 메스 팁을 주기적으로 닦아 청결함과 날카로움을 유지하십시오.

해면골 층이나 골소주가 보일 때까지 계속합니다. 후각구의 미세 혈관이 보이면 뼈를 긁어내는 것을 멈추고, 11번 메스 끝을 사용하여 후각구를 둘러싸는 직사각형 영역을 그립니다. 정맥동의 경계 내에 창을 유지하면서 직사각형 영역 내의 뼈를 계속 긁어냅니다.

경막 표면에 닿지 않도록 메스 팁의 깊이에 각별히 주의하십시오. 남은 뼈의 두께를 가늠하기 위해 포셉 팁으로 부드럽게 밀어봅니다. 압력을 가했을 때 뼈가 밀려나면 다음 단계로 진행하십시오.

식염수를 한 방울 가하고, 가로 방향으로 놓인 메스 끝을 사용하여 골편(bone flap)을 들어 올립니다. 남은 뼈가 찢어지지 않도록 핀셋을 사용하여 조심스럽게 골편을 제거합니다. 후각구(olfactory bulb) 표면이 노출되면 출혈이나 혈관이 없는지 확인합니다.문합술(Anastomosis).

식염수에 적신 젤라틴 스펀지로 해당 부위를 닦아냅니다. 후각구의 습윤 상태를 유지하기 위해, 29 gauge 주사기를 사용하여 폴리아크릴레이트 치과용 시멘트를 도포함으로써 두개창 주변의 뼈 위에 웰(well)을 형성합니다. 경막 위에 저융점 aros 한 방울을 떨어뜨리고, 영상 촬영을 위해 두개창 위에 멸균 커버 글라스를 덮습니다.

정위 고정 장치를 실체 현미경 아래에 두고, 모세혈관이 보일 때까지 초점을 맞추어 두개창을 시야 중심에 위치시킵니다. 580 nanometer 녹색광으로 전환하여 해부학적 대조 이미지를 캡처함으로써 촬영 중 표본의 상태를 확인합니다. 그런 다음 630 nanometers 조명 하의 내인성 광학 신호 영상(intrinsic optical signal imaging) 또는 480 nanometers 조명 하의 플라보단백질 자가형광 신호 영상(flavoprotein autofluorescent signal imaging)을 사용하여 자극 시험 캡처를 진행합니다. 표준 영상 세션은 공기만 공급되는 5~10 seconds의 기저 상태를 포함하며, 이후 선택한 냄새 농도에 따라 3~10 seconds 동안 냄새 자극을 가합니다.

마지막으로, 기선 회복을 위해 70~82초 동안의 공기 주입 과정이 기록됩니다. 여기서는 두개창을 통해 후각구의 혈관계를 촬영하며, 이어서 iOS 및 FAS 이미징을 모두 사용하여 포착한 h sinal 취기 자극 시험 결과가 제시됩니다. iOS 이미징에서 취기에 의해 유도된 활성은 어두운 흡광 영역으로 표시되며, AL에 의해 활성화된 영역은 흰색 화살표로 나타내었습니다. 활성 영역은 단일 시험과 여러 번의 평균 시험 모두에서 확인할 수 있습니다.

동일한 마우스의 OD에서 FAS 이미징으로 전환하면, 검은색 화살표로 표시된 것처럼 유도된 활동이 백색의 자가형광 방출 영역으로 나타나며, 이는 단일 시행 및 평균화된 다중 시행 모두에서 확인될 수 있습니다. iOS 이미징에서 관찰된 흑색 흡수 영역과 FAS 이미징에서 관찰된 백색 자가형광 방출 영역이 서로 겹친다는 점에 주목하십시오. 이러한 공간적 일치는 두 기술이 동일한 후각 사구체를 시각화할 수 있음을 확인시켜 줍니다. 일단 마스터 이미징이 설정되면, 광 반사 및 자가형광 신호를 이용한 유도 활동 관찰은 수술에 1시간, 이미지 획득에 몇 시간이 소요됩니다.

이러한 광학 영상법을 사용하는 주요 단점은 자유롭게 움직이는 생쥐의 후각 지도를 시각화하는 방식으로 적용할 수 없다는 점입니다. 또한, 생물학적 조직으로의 광자 투과가 제한적이기 때문에, 후각 시스템의 내재적 신호를 기록하는 과정에서 발달 후기의 복측 후각 사구체에 접근할 수 없습니다. 이는 아마도 광학 영상 분야의 연구자들이 od의 특수 코팅 특성을 탐구할 수 있는 방법이 될 것입니다.

후각구의 플라보단백질 자가형광 이미징은 내인성 광학 신호를 이용하여 후각신경세포수지상돌기(OD)의 특수 코팅에 대한 새로운 통찰을 제공하는 유망한 기술입니다.