DNA 기반의 어종 식별 프로토콜

어류 종 식별 시스템은 주어진 시료에 존재하는 어류 종을 식별하기 위한 간단하고 빠르며 정확한 DNA 기반 방법입니다. 어류 시료는 단백질 분해 효소인 proteinase K로 처리하여 핵산을 용액 내로 방출시킵니다. 그 후 어류의 genomic DNA를 분리하고, 모든 어류 게놈에서 발견되는 서열에 결합하는 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭합니다.

그 후 PCR 산물을 세 가지 서로 다른 제한 효소로 처리하고 Agilent 2100 bioanalyzer로 분석합니다. 제한 효소 소화 반응으로 생성된 단편의 길이는 제한 효소 절편 길이 다형성, 즉 RFLP 패턴 매칭 소프트웨어를 사용하여 어류의 종을 결정하는 데 활용될 수 있습니다. 안녕하세요, Agilent Technologies의 Rachel Formosa입니다.

오늘은 DNA 기반의 어종 식별 절차를 보여드리겠습니다. 이 절차는 신선하거나 냉동, 다져진 상태, 조리, 건조 또는 기타 가공된 샘플에 포함된 어종을 식별할 수 있는 스크리닝 방법입니다. 그리고 이는 근무일 기준 하루 이내에 완료할 수 있습니다.

우리는 이 절차를 통해 수산물의 진위 여부를 연구합니다. 대체 및 오표기는 상당한 경제적, 환경적 영향과 식품 안전 문제를 야기할 수 있으므로 이는 수산 업계에서 매우 중요합니다. 또한, 시각적 식별 및 기타 전통적인 방법으로는 어종을 판별하는 것이 특히 어려울 수 있습니다. 생선이 가공된 후에는 DNA 검사를 통해 훨씬 더 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 각 생선 샘플당 10에서 1000 mg의 생물 또는 조리된 생선 조직 샘플을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣어 DNA 추출을 위한 샘플 준비를 시작하십시오. 갓 조제한 proteinase K 용액 220 µL를 샘플에 넣고 피펫팅하여 섞어줍니다.

튜브를 65 °C에서 10분 동안 배양한 후, 14,000 Gs에서 3~5분 동안 원심분리하여 소화되지 않은 조직을 펠릿화합니다. 다음으로, 바닥의 소화되지 않은 물질과 상층의 기름진 물질이 섞이지 않도록 주의하며, 각 상층액 150 µL를 새로운 1.5 mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 이제 이 상층액을 게놈 DNA 추출에 사용합니다.

각 샘플에 핵산 결합 완충액 500 µL를 첨가하여 게놈 DNA 추출을 시작합니다. 이렇게 하면 총 샘플 부피는 650 µL가 됩니다. 샘플이 균질해질 때까지 볼텍싱합니다.

다음으로, 각 시료를 키트에 제공된 2 mL 수용 튜브 중 하나에 안착시킨 DNA 결합 스핀 컵으로 옮깁니다. 튜브 캡을 스핀 컵 상단에 딸깍 소리가 나게 닫습니다. 14,000 Gs에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 스핀 컵 매트릭스에 로딩합니다.

원심분리가 끝나면 스핀 컵을 꺼내 여과액을 버리고, 컵을 다시 수용 튜브에 넣습니다. 1x 고염 세척 완충액 500 µL를 추가합니다. 튜브의 캡을 닫고 다시 원심분리를 수행합니다.

여과액을 버리고, 스핀 컵을 다시 수용 튜브에 넣습니다. 이제 80% ethanol 500 µL를 첨가합니다. 튜브 캡을 닫고 14,000 Gs에서 1분 동안 원심 분리합니다.

80% ethanol로 세 번째 세척을 마친 후, 에탄올 세척을 두 번 더 반복하고 여과액은 버립니다. 스핀 컵을 수용 튜브에 다시 넣고, 이번에는 2분 동안 원심분리하여 섬유 매트릭스를 건조합니다. 이제 스핀 컵을 1.5 milliliter 수집 튜브로 옮깁니다.

각 스핀 컵 내부의 파이버 매트릭스 위에 용출 버퍼 100 µL를 직접 첨가합니다. 그런 다음 컬렉션 튜브 캡을 스핀 컵에 끼우고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 배양 후, 샘플을 최대 속도로 1분 동안 원심 분리합니다.

다음으로, 스핀 컵을 버리고 튜브의 캡을 닫습니다. DNA 농도를 측정할 경우, 5 ng/µL에서 500 ng/µL 범위의 농도가 예상됩니다. DNA는 4 °C에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있으며, 장기 보관이 필요한 경우 DNA를 -20 °C 또는 -80 °C에 보관하십시오.

P-C-R-R-F-L-P 시약 키트에 제공된 프라이머와 시약을 사용하여 PCR을 수행합니다. 동봉된 서면 프로토콜에 따라, PCR 진행 시 양성 대조군, 음성 대조군 및 템플릿 미첨가 대조군을 포함한 각 샘플을 중복으로 실험하는 것이 권장됩니다. 1.5 µL의 멸균 증류수, 0.5 µL의 10x 효소 버퍼, 0.5 µL의 10x 효소를 순서대로 혼합하여 DTE E one HAE three 및 NL three 소화를 위한 제한 효소 마스터 믹스를 준비합니다.

모든 샘플과 1회 분량의 추가 반응 부피를 포함하여 충분한 양의 fourex three 시약 혼합물을 준비하십시오. 그런 다음 샘플 및 효소 이름이 표시된 각 반응 튜브에 2.5 µL씩 분주하십시오. PCR이 완료되면 샘플을 열 순환기(thermal cycler)에서 꺼내 얼음에 놓으십시오.

각 반응에 해당하는 세 개의 제한 효소 소화 튜브에 각 PCR 생성물을 2.5 µL씩 첨가합니다. DDE 한 개, HAE 세 개, NLA 세 개입니다. 그다음 보텍스합니다.

짧게 원심 분리한 후, 소화액을 37°C에서 2시간 동안 배양하십시오. 상황에 따라 소화액을 하룻밤 동안 배양해도 무방합니다. 소화 과정이 끝난 후, 반응물을 65°C에서 15분 동안 배양하십시오.

그런 다음 각 튜브에 60 millimolar EDTA 1 µL를 첨가하여 반응을 중단시키고 볼텍싱합니다. Agilent bioanalyzer reagent kit를 사용하여, 키트 안내서에 따라 제한효소 절단물을 A DNA chip의 웰에 준비하고 로딩합니다. 각 샘플의 경우, 세 가지 절단물을 모두 동일한 칩에 로딩해야 합니다.

그런 다음 칩을 볼텍싱하고 장비에 로드합니다. 가동이 완료되면 분석 컨텍스트로 이동하여 칩 요약 탭을 선택하십시오. 샘플 이름 필드에 칩의 12개 웰 모두에 대한 샘플 이름을 입력하여 테스트 DNA 샘플의 어종을 식별하십시오.

파일을 클릭하여 RFLP 디코더 프로그램을 실행하십시오. 그런 다음 XAD 파일을 엽니다. 파일 열기 대화 상자가 나타납니다.

이제 사용된 DNA 칩에 해당하는 XAD 파일을 선택하십시오. 그리고 열기를 클릭하여 칩에 로드된 샘플 목록을 확인합니다. 첫 번째 DNA 샘플에 해당하는 세 개의 소화물(digests)을 선택하십시오.

효소 열 아래에, lower marker의 백분율로 표시된 최소 피크 높이(min peak height) 레이블이 지정된 필드에 사용된 제한 효소를 지정하십시오. 기본값은 필요 시 10%입니다. 이 값은 누락된 작은 피크를 식별하기 위해 낮추거나, 전기영동도의 비특이적 노이즈로 인해 발생한 피크를 제거하기 위해 높일 수 있습니다.

최소 피크 높이(min peak height) 값을 조정한 후, reintegrate를 클릭하십시오. 이제 대화 상자 하단의 calc를 클릭하십시오. 바이오어낼라이저(bioanalyzer) 가동을 통해 얻은 단편 길이 데이터가 소프트웨어 필드에 입력됩니다.

다음으로 화면 왼쪽 상단의 점수 드롭다운 목록에서 dice를 선택하십시오. 어류 시료가 단일 어종 또는 혼합물로 구성된 경우, 혹은 시료가 혼합물일 가능성이 있는 경우, 화면 하단에 combined score list라고 표시된 표를 확인하십시오. 이 표에는 세 가지 소화 반응 결과 모두를 바탕으로 가장 잘 일치하는 종이 표시됩니다.

점수가 1점인 완전 일치는 녹색으로 표시됩니다. 근접 일치는 화면 상단에 노란색으로 표시됩니다. 하한 컷오프 값은 분석에 사용된 최소 프래그먼트 크기를 지정하며, 일치 허용 오차 값은 프래그먼트가 예측된 프래그먼트와 길이가 얼마나 가까워야 일치하는 것으로 간주할지를 결정합니다.

표시된 값은 기본 설정이며 조정 가능합니다. 팁에 남아 있는 나머지 DNA 샘플 분석을 위해 이 단계들을 반복하십시오. 이 비디오에서 설명한 방법을 사용하여 네 가지 서로 다른 어종의 DNA 샘플을 분리, 증폭 및 소화시켰습니다.

Agilent Bioanalyzer와 RFLP 디코더를 사용하여 제한효소 절단 샘플을 나타낸 바이오분석기 겔이 여기에 제시되어 있습니다. 소프트웨어 밴딩 패턴을 통해 어종을 식별합니다. 첫 번째 샘플은 송어로, 두 번째는 참치로, 세 번째는 바위납자로 정확하게 식별되었습니다.

마지막 샘플은 특정 대구(cod)입니다. 지금까지 Agilent의 P-C-R-R-F-L-P 방법을 이용한 DNA 기반 어종 식별법을 보여드렸습니다. 이 방법은 매우 민감하므로, 실험 절차를 수행할 때 샘플 간 교차 오염이 발생하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 이제 샘플에 포함된 어종을 빠르고 쉽고 정확하게 식별하는 방법을 알게 되셨습니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.