액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 유독 복어의 개선 중합 효소 연쇄 반응 - 제한 조각의 길이 다형성 유전자형

본 실험의 전반적인 목표는 소형 PCR 증폭 산물을 분석하여 독성 복어의 신속하고 정확한 유전자형 분석을 수행하는 것입니다. 복어 요리를 준비할 때 사용되는 복어의 식용 부위는 종마다 다르며, 일부 종은 몸 전체에 독성을 가지고 있습니다. 복어의 근육, 데이터베이스, 마수, 지느러미 및 피부를 이용한 분석은 모두를 위한 식품 안전 확보 및 연구 관점에서 복어의 유전자형 분석에 도움이 될 수 있습니다.

키트를 사용하여 DNA 추출을 수행하려면, 먼저 30~50 mg의 어류 조직을 0.5 또는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다. 마이크로스패튤라를 사용하여 지느러미와 피부를 제외한 조직을 으깹니다. 180 µL의 동물 조직 용해 버퍼와 40 µL의 proteinase k를 첨가하고 짧게 볼텍싱합니다.

블록 히터를 사용하여 56 °C에서 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 샘플을 13000×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후, 키트에 포함된 guanidine hydrochloride 함유 카오트로픽 버퍼(chaotropic buffer) 200 µL를 첨가합니다.

그 다음 99.5% ethanol 200 µL를 첨가하고 볼텍싱하여 섞습니다. 침전물을 포함한 혼합물을 2 mL 컬렉션 튜브에 장착된 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 13000×g에서 1분 동안 원심분리한 후, 통과액을 제거합니다.

키트에 포함된 guanidine hydrochloride가 함유된 세척 버퍼 1 500 µL를 첨가하고 이전과 동일하게 원심분리합니다. 통과액과 컬렉션 튜브를 폐기합니다. 스핀 컬럼을 키트에 제공된 새로운 2 mL 컬렉션 튜브에 넣습니다.

세척 버퍼 2(wash buffer two) 500 µL를 첨가하고 20,000xg에서 3분 동안 원심분리합니다. 통과액과 수집 튜브를 버린 후, 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 용출 버퍼(elution buffer) 200 µL를 스핀 컬럼 멤브레인의 중앙에 피펫팅합니다.

1분 후, 6000xg에서 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액 50 µL를 일회용 자외선 큐벳에 분주합니다. 분광광도계를 사용하여 상층액의 220에서 300 nm 범위의 자외선 스펙트럼과 260 nm에서의 흡광도를 측정합니다.

분석 컬럼에 손상을 줄 수 있으므로 액체 크로마토그래피의 성공을 위해서는 계면활성제가 없는 시약을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 오염을 방지하기 위해 클린 벤치에서 작업하며, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 얼음 위에서 각 추출 DNA 샘플, 양성 대조군 및 음성 대조군에 대해 25 µL PCR을 설정하십시오. 원활한 작업을 위해 템플릿 DNA를 제외한 모든 시약이 포함된 칵테일을 충분한 양으로 제조하여 분주하십시오.

PCR 생성물에 3' 아데닌 오버행(overhang)이 추가되는 것을 방지하기 위해 교정 활성(proofreading activity)이 있는 DNA polymerase를 사용하십시오. 텍스트 프로토콜에 제시된 사이클 프로그램을 사용하여 써멀 사이클러(thermal cycler)에서 PCR 증폭을 수행하십시오. 효소 절단을 수행하려면 PCR 용액에 효소 절단 버퍼 2 µL를 추가하십시오.

각 제한 효소를 1 µL씩 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 샘플을 써멀 사이클러(thermal cycler)에서 37 °C로 30분 동안 배양한 후, 72 °C에서 5분 동안 배양합니다. 막힘을 방지하고 분석 컬럼의 손상을 피하기 위해 0.2 내지 0.5 µm 원심 분리 필터 장치로 반응 용액을 여과합니다.

여과액을 원추형 폴리프로필렌 바이알로 옮기고 분석 전까지 20 °C에서 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 1 L 병에 hexafluoroisopropanol과 triethylamine 용액을 준비하십시오. 병을 액체 크로마토그래피 장치의 라인 A에 연결하고, 기화를 방지하기 위해 직접 냉각식 휴대용 냉장고를 사용하여 병을 냉각하십시오.

메탄올이 채워진 다른 병을 라인 B에 연결하십시오. 가드 컬럼과 분석 컬럼을 기기에 연결하십시오. 컬럼을 평형화하기 위해 초기 이동상을 흘려주기 시작하십시오. C-Trap 압력을 제어하는 소프트웨어가 없는 질량 분석기를 사용하는 경우, 바(bar)를 수동으로 조절하여 C-Trap의 압력을 낮추어야 합니다.

이를 위해 노브를 당겨 잠금을 해제하고, 노브를 매우 천천히 반시계 방향으로 돌려 고진공 압력을 1/3로 낮춥니다. 표시된 압력은 지연된 방식으로 점진적으로 변해야 합니다. 저압에 관한 경고 메시지는 무시하십시오.

노브를 밀어 잠급니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 캘리브레이션 설정을 마친 후, 가열된 전기분무 이온화 프로브를 질량 분석기 인터페이스의 B 위치로 더 가깝게 이동시킵니다. 프로브와 튜브가 연결된 시린지를 연결합니다. 내장된 시린지 펌프를 사용하여 10 µL/min의 유속으로 캘리브런트를 지속적으로 주입합니다.

사용자 정의 교정 표에서 질량이 낮은 6개의 이온만 확인하십시오. 신호 강도가 안정화되면 교정을 진행하십시오. 교정이 끝나면 질량이 높은 6개의 이온만 확인한 후 다시 교정을 진행하십시오.

실패를 방지하기 위해 모든 이온을 한 번에 교정하는 것은 피하십시오. 유량을 0.4 milliliters per minute로 설정하여 프로브를 위치 D로 이동시키고, 불활성 금속 튜브를 사용하여 기기에 연결합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 파라미터를 설정한 후, 바이알 바닥을 톡톡 쳐서 기포를 제거하십시오.

시료 바이알을 시료 랙에 배치하고 오토샘플러를 사용하여 시료 1 µL를 주입하여 분석을 시작합니다. 브라우저 소프트웨어로 로우 데이터 파일을 열어 양성 및 음성 대조군을 포함한 모든 획득 과정이 성공적으로 완료되었는지 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 분석 방법을 설정한 다음, 런 큐(run cue) 탭의 실행 버튼을 클릭하여 디컨볼루션 소프트웨어를 시작합니다.

큐가 완료되면 행을 선택하고 상단 캡션의 결과 열기(open result)를 클릭하여 디컨볼루션 결과를 확인합니다. 다음은 음성 대조군과 복어 샘플에서 얻은 전형적인 총 이온 전류 크로마토그램입니다. 각 피크는 길이에 따라 분리된 DNA 이중나선을 나타냅니다.

이 예시에서는 복어 샘플에서 세 개의 피크가 관찰됩니다. 이러한 피크는 두 종류의 엔도뉴클레아제를 이용한 앰플리콘 소화의 결과입니다. 음성 대조군 샘플에서는 피크가 관찰되지 않습니다.

각 피크는 다가 이온으로 구성된 질량 분석 스펙트럼을 나타냅니다. 질량 분석 스펙트럼을 확대하면 수십 개의 동위원소 분해 피크를 확인할 수 있습니다. 이러한 분해능은 단일 동위원소 질량을 결정하는 데 필수적이며, 고분해능 질량 분석기를 통해서만 가능합니다.

이 예시에서 세 번째 피크의 단일동위원소 질량은 16296.7656 및 16468.6616 Dalton입니다. 3 ppm의 질량 허용 오차를 고려할 때, 측정값은 여기에 표시된 takifugu rubripes의 이론값과 일치합니다. 이 기술을 숙달하면 일반적인 기기 및 장치를 사용하여 하루 만에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 유전자형 분석을 위해 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석법으로 작은 증폭 산물을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 분석 대상인 작은 증폭 산물에 서열 변이가 반영되어 있다면 다른 DNA 다형성을 분석하는 데에도 적용할 수 있습니다. 다만, 이 기술은 염기 조성만을 식별하므로 동일한 질량 내에서의 염기 치환은 구분할 수 없습니다.