실험 전이 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 꼬리정맥 주입을 통해 인간 암세포의 전이 능력을 테스트하는 것입니다. 먼저 면역결핍 마우스에 주입할 세포를 준비합니다. 그 다음, 준비된 세포를 면역결핍 마우스에 주입하며, 주입 후 1~2개월이 지나면 폐 전이가 발생하게 됩니다.

마우스를 해부하여 폐 전이를 정량화하고 배양합니다. 이러한 유형의 분석 결과는 특정 유형의 암세포의 전이 정도를 나타냅니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 생의학 유전학과의 Dr.LE 연구실 소속 Sonali Mohanty입니다.

오늘은 실험적 전이 분석을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 암 전이를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

약 70% 밀도로 배양된 세포에서 시작하여 플레이트의 배지를 흡입하고 1X PBS로 한 번 가볍게 세척합니다. 다음으로 0.05% Trypsin을 2 mL 첨가합니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 세포 분리를 촉진합니다.

현미경으로 세포가 떨어지는 것을 관찰하십시오. 트립신 활성을 중단시키기 위해 FBS가 포함된 배지를 충분한 양으로 첨가하십시오. 그런 다음 50 milliliter 튜브로 옮기십시오.

혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 농도가 결정되면, 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 약 200 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다. 배지를 조심스럽게 제거한 후, 적절한 부피의 Hank's balance buffer solution 또는 HBSS를 가해 최종 농도가 약 5 × 10⁶ cells/mL가 되도록 재현탁합니다.

다음으로, Falcon사의 70 µm 셀 스트레이너로 여과합니다. 커다란 세포 응집체를 제거하기 위해, 5 mL 배양 튜브 위에 놓인 필터 위에 피펫 팁을 직접 댑니다. 현탁액을 필터를 통해 튜브 속으로 빠르게 배출합니다.

트리판 블루(trypan blue)를 사용하여 세포 수를 다시 측정하여 생존율을 결정합니다. 주입 전 생존율은 90% 이상이어야 합니다. 그 후 최종 농도가 2.5 × 10⁶ cells/mL가 되도록 희석합니다.

얼음 위에 보관하십시오. 면역결핍 마우스의 꼬리를 살며시 잡고, 마우스의 등이 슬릿에 닿게 하여 꼬리가 뒤쪽의 작은 구멍 밖으로 나오도록 마우스 보정기에 넣습니다. 슬릿을 따라 링을 천천히 안쪽으로 밉니다.

링이 마우스의 입 부분을 잡으면 고정시킵니다. 마우스가 자유롭게 움직이지 못해야 하며, 호흡률은 정상이어야 합니다. 주요 꼬리 정맥을 찾습니다.

마우스 꼬리에는 네 개의 주요 혈관이 존재합니다. 동맥은 꼬리의 등쪽과 배쪽에 위치하며, 정맥은 가쪽 면에 위치합니다.

준비된 세포 200 µL 이상을 1 mL 주사기로 흡입합니다. 30게이지 반침(half needle)을 장착하고 기포를 모두 밀어냅니다. 주사기 내의 최종 부피는 200 µL가 되어야 합니다.

꼬리 원위단에 주사할 준비를 합니다. 이렇게 하면 첫 번째 시도에 실패했을 경우, 두 번째 시도로 꼬리의 더 근위 영역을 사용할 수 있습니다. 주사 부위를 70% ethanol로 닦아낸 후, 꼬리를 곧게 폅니다.

엄지로 팁을 잡고 검지로 주입 지점을 지지합니다. 바늘을 정맥에 삽입하고 세포를 주입합니다. 주입하는 동안 바늘과 주사기가 정맥과 평행을 유지하도록 합니다.

그렇지 않으면 바늘이 혈관 벽을 관통하여 세포가 인접한 꼬리 조직으로 주입될 것입니다. 절차가 성공적으로 완료되었다면 바늘을 뺍니다. 주입 부위에서 혈액이 역류해야 합니다.

깨끗한 솜 뭉치를 눌러 플로싱(flossing)을 용이하게 하고, 꼬리 부분을 위쪽으로 촉진하여 잔류 시료가 혈류로 유입되도록 밀어줍니다. 구속 장치에서 마우스를 풀어 케이지로 돌려보냅니다. 주입 횟수와 주입된 세포 수를 실험 노트에 기록합니다.

주입 후 세포의 생존율을 결정합니다. 이전 단계와 마찬가지로, 이 단계는 주입 과정 전반에 걸쳐 세포가 살아있음을 확인하는 절차입니다. 주입 실험이 끝날 때 세포의 생존율은 감소하지만, 80% 이상으로 유지되어야 합니다. 선택 사항으로, 남은 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후 펠릿을 PBS로 한 번 세척하십시오.

그 후, 웨스턴 블로팅과 같은 향후 분석을 위해 펠렛을 -80°C에서 냉동 보관하십시오. 녹다운된 유전자의 발현을 확인하기 위해, 1~2개월 후에 마우스를 적출하여 전이 위치를 확인합니다. 먼저 안락사시킨 마우스를 적출대 위에 올려놓으십시오.

마우스에 에탄올을 충분히 분사합니다. 흉곽을 절개하여 폐와 심장을 노출시킵니다. 그런 다음 이를 조심스럽게 적출하여 PBS에 넣습니다.

폐는 세포가 처음으로 마주하는 모세혈관망이 위치해 있어 전이의 주요 부위가 됩니다. 세포가 혈류로 진입한 후, 심장을 제거하고 폐를 PBS로 헹군 다음 해부 현미경으로 폐의 각 엽을 관찰하십시오. 폐의 양쪽에서 검출 가능한 전이 개수를 세고, 4개 엽 전체의 폐 전이 수를 합산하여 총 폐 전이 수를 결정하십시오.

다음으로, 가위를 사용하여 개별 폐 전이물을 절제하여 분리합니다. 각 전이물을 70 µm 세포 스트레이너로 옮기고 멸균된 니들 캡의 끝부분을 사용하여 잘게 다집니다. 세포 스트레이너를 수 밀리리터의 배지로 헹구고 필터를 통과한 세포를 수집합니다.

배양 접시에 각 전이 부위에서 유래한 세포를 각각 담습니다. 세포를 37 °C에서 최소 4일 동안 교란 없이 배양합니다. 초기에는 암세포와 섬유아세포가 모두 플레이트에서 성장하지만, 점차 섬유아세포는 사멸하고 암세포로 대체됩니다.

암세포가 약물 내성 유전자를 보유하고 있는 경우, 해당 항생제를 사용하여 세포를 선택합니다. 3일 후, PBS로 디쉬의 혈액이나 조직 잔해물 및 찌꺼기를 씻어내고 신선한 배지를 추가합니다. 인간 특이적 단백질에 대한 항체를 이용한 면역 염색을 통해 유래된 세포의 순도를 평가하며, 여기서는 약물 선택 과정이 없는 경우에도 anti-human 항체가 사용됩니다. 세포의 99% 이상이 인간 세포여야 합니다.

새로 유도된 세포들을 면역결핍 마우스에 다시 주입하여 이 분석법의 마지막 단계에서 전이 능력을 테스트할 수 있습니다. 전이 능력이 매우 높은 암 세포주는 일반적으로 많은 폐 전이를 유발하는 반면, 전이 능력이 낮은 암 세포주에서는 폐 전이가 거의 나타나지 않습니다. 이 이미지들은 인간 흑색종 세포주를 주입한 2개월 후의 폐 전이 양상을 보여줍니다.

3 7 5 sm입니다. 이 방법으로 유도된 세포들은 일반적으로 테스트 시 모세포주보다 더 많은 전이를 일으킵니다. 다시 한번 이 분석법을 통해, 실험적 전이 분석을 수행하는 절차를 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때, 세포가 꼬리 조직이 아닌 꼬리 정맥으로 정확히 주입되도록 하는 것이 매우 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.