실험 전이 및 CTL 입양 전송 Immunotherapy 마우스 모델

본 절차의 전반적인 목표는 생체 내(in vivo)에서 종양 특이적 T-세포 입양 전이 면역요법의 효능을 검토하는 것입니다. 이를 위해 먼저 쥐의 측면 꼬리 정맥 주사를 통해 종양 세포를 이식하여 폐 전이를 유도합니다. 절차의 두 번째 단계는 종양이 형성된 쥐에게 종양 특이적 세포독성 T 림프구(CTLs)를 투여하여 치료하는 것입니다.

마지막 단계는 인디아 잉크(India ink)를 사용하여 종양 결절을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 궁극적으로 종양의 크기를 측정하고 종양 결절의 수를 정량화함으로써 서로 다른 치료법의 CIE를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 조지아 의과대학(Medical College of Georgia)의 Kevin Lu 박사 연구실 소속 Mary Zimmerman입니다.

안녕하세요, 제 이름은 Shelene Hu입니다. 저는 2학년 학생이며 Lou 박사님의 연구실에서 근무하고 있습니다. 생존 곡선과 같은 전통적인 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 이 절차가 정성적 분석과 정량적 분석이 모두 가능하다는 점입니다. 이 기술의 시사점은 인간 암 환자의 T세포 입양 면역 요법을 모방하기 때문에 암 치료 분야로 확대될 수 있습니다.

이제 시작하겠습니다. 종양 세포 주입 전날, 10% 혈청이 포함된 10 mL RPMI 배지에 최대 1×10⁷개의 CMS-4MET 세포를 T75 플라스크 하나에 분주합니다. 빠르게 성장하는 종양 세포를 얻기 위해 37°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 주입 당일에 사용하십시오.

배지를 제거하고 PBS로 세포를 1회 세척한 후, 37°C에서 0.05% trypsin EDTA를 사용하여 5분 동안 종양 세포를 수확합니다. 10% serum이 포함된 RPMI 배지 10 mL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 세포를 원심분리 튜브(conical tube)로 옮깁니다.

val legend RT 원심분리기를 사용하여 1300 RPM에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다. 상온에서 상층액을 제거하고, 세포를 세척하기 위해 10 mL의 신선한 1 XHB Ss에 재부유시킵니다. 그런 다음 동일한 방식으로 다시 원심분리하고 재부유시킵니다.

hemo.Cytometer를 사용하여 종양 세포 수를 측정하십시오. 각 주입에 필요한 세포가 재현탁되도록 HBSS로 세포를 희석하십시오. 따뜻한 물에 담근 비커 안에서 6~8주 된 B SEA 마우스를 총 100 microliters 부피로 가온하십시오.

미미정맥을 확장시키기 위해 마우스를 벤치 위의 미미정맥 보정기에 고정합니다. 마이크로 시린지를 사용하여 종양 세포 100 µL를 미미 외측 정맥에 주입합니다. 주입 후 감염을 방지하기 위해 무균 조작법을 사용하십시오.

출혈이 멈출 때까지 주사 부위를 가볍게 압박합니다. 마우스를 케이지로 옮기고 종양이 원하는 단계까지 성장하도록 둡니다. 전이 당일에, 준비된 정제된 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes) 또는 CTL을 재현탁하기 위해 피펫팅을 수행합니다.

본문에 설명된 대로, 모든 세포를 한 플레이트에서 15 milliliter 원추형 튜브로 옮기되, 튜브 부피의 3분의 2를 초과하지 않도록 합니다. 멸균된 파스퇴르 피펫을 원추형 튜브에 삽입하고, 총 부피가 14 milliliters에 가까워질 때까지 세포 아래에 림프구 분리 배지 또는 LSM을 층지게 추가합니다.

층이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 실온에서 2000 RPM으로 20분 동안 원심분리합니다. 회전 후 로터를 감속시키기 위해 브레이크를 사용하지 말고, CTL을 새로운 15 milliliter 코니컬 튜브로 옮기십시오.

HBSS를 약 10mL 부피가 되도록 추가합니다. 세척을 위해 세포를 1300 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상온에서 HBSS를 사용하여 주입에 필요한 세포 밀도로 재현탁합니다.

주입당 총 부피를 100 microliters로 유지하십시오. 이 비디오 앞부분에서 보여준 것과 동일한 꼬리 주입 기술을 사용하십시오. 종양 보유 마우스에 CTL을 주입한 후, 마우스를 케이지로 되돌려 CTL이 종양과 상호작용하도록 하십시오.

마우스는 일반적으로 CTL 처리 후 14~21일 뒤에 분석을 위해 희생시킵니다. 폐 전이를 시각화하려면, 희생된 마우스를 스티로폼 보드 위에 등 쪽이 바닥으로 가게 놓습니다. 기관으로의 접근이 원활하도록 다리를 핀으로 고정합니다.

복부 중간 부분부터 시작하여 복측면에 70% ethanol을 분사합니다. 가위를 사용하여 흉곽을 통해 정중선을 따라 침샘 방향으로 절개합니다. 기관을 노출시킵니다.

포셉을 사용하여 기관 주변의 조직을 제거합니다. 한 손으로 200 µL 피펫 팁을 잡고 기관 아래로 밀어 넣습니다. 기관을 몸체에서 조심스럽게 들어 올려 분리합니다.

플랫폼을 180도 회전시킵니다. 50 milliliter 주사기를 사용하여 기관을 통해 폐에 인디아 잉크를 주입합니다. 강한 저항이 느껴질 때까지 잉크로 폐를 완전히 팽창시킵니다.

가위로 기관을 절단합니다. 핀셋을 폐 아래로 밀어 넣어 폐를 마우스에서 들어 올립니다. 화학 흄 후드 내에 있는 1 liter 비커의 물로 폐를 짧게 헹굽니다.

폐를 5 mL의 FTI 용액이 담긴 유리 용기로 옮깁니다. 종양 조직은 검은색 폐 위에 흰색 결절로 나타납니다. 몇 분 후, 종양의 수를 세고 FTI 용액 내에서 무기한 보관할 수 있습니다.

유선암이 전이된 마우스의 폐. 4T1 세포주에서는 종양을 나타내는 흰색 점들이 관찰됩니다. IRF8 우성 음성 돌연변이체 K79E가 전이된 마우스에서는 종양 세포의 전이 잠재력이 증가한 것을 보여줍니다.

이 이미지들은 CTL 입양 전이 면역요법의 효능에 대한 조직학적 분석 결과를 보여줍니다. 생리식염수를 주입한 종양 보유 마우스의 경우, 6일 후에 화살표로 표시된 것처럼 다수의 종양이 나타났습니다. 반면, 종양 특이적 T 세포를 주입한 마우스는 동일한 실험에서 종양이 감소한 것을 확인할 수 있었습니다.

인디아 잉크 처리는 CTL 입양 전이의 효능을 측정하는 더 간단한 방법을 제공합니다. 여기서는 종양이 생성된 폐의 흰색 종양 결절이 CTL 입양 전이가 성공적으로 이루어진 폐와 명확하게 구분되며, 결절 수를 세는 것을 통해 조직학으로는 불가능한 수준의 정량화가 가능합니다. 이 절차를 수행할 때, 더 쉽고 정확한 꼬리 정맥 주사를 위해 마우스를 미리 가온하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

이 영상을 시청하신 후에는, 종양의 크기와 수를 정량화하는 이 간단한 절차를 통해 치료 효능을 평가하는 방법을 충분히 이해하시게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.