헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

이 절차는 두 가지 Arabidopsis 전사 조절인자인 SEU 및 LUH 사이의 생체 내(in vivo) 단백질-단백질 상호작용을 테스트합니다. 생분자 형광 보완법(biomolecular fluorescence complementation)을 활용하여, SEU는 황색 형광 단백질(YFP)의 N-말단 단편에 융합시키고, LUH는 YFP의 C-말단 단편에 융합시키기 위해 두 가지 플라스미드 컨스트럭트의 DNA를 사용합니다. 상호작용 여부를 테스트하기 위해 SEU-NYFP 및 LUH-CYFP를 양파 표피 세포에 bombardment 방식으로 도입합니다.

Seuss와 LUH 사이의 상호작용은 핵 내에서 YFP의 말단 단편과 C-말단 단편의 결합을 유도하여 핵 내 YFP 형광을 발생시킵니다. 암실에서 16~20시간 동안 배양한 후, 양파 표피 박편을 형광 현미경으로 관찰하여 형광을 시각화합니다. 안녕하세요, 메릴랜드 대학교 세포생물학 및 분자유전학과의 Zhi Lu 교수님 연구실 소속 Courtney Hollander입니다.

오늘은 BioRad Helios 유전자 총(gene gun)을 사용하여 양파 세포 내의 단백질-단백질 상호작용을 테스트하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 식물 세포 내의 단백질-단백질 상호작용 및 단백질 위치를 테스트하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하려면, 각 카트리지 준비 과정을 상세히 보여주는 Woods와 Zeto(2008)의 JoVE 프로토콜에 따라 Helios 유전자 총(gene gun)용 카트리지를 준비하십시오. BIFC를 위해 50 µg의 총 플라스미드 DNA를 12.5 mg의 금 입자 및 0.5 mg/mL의 PVP 용액과 혼합합니다. 동일한 카트리지 준비 방식으로, YFP의 N-말단 절반에 융합된 추정 상호작용 단백질 Seuss(약어: seus-NYFP)와 YFP의 C-말단 절반에 융합된 LU Homolog(약어: L-U-H-C-Y-F-P)의 두 플라스미드 DNA를 결합합니다.

총량은 prep당 50 µg이며, 카트리지당 0.25 mg의 금당 1 µg의 DNA 비율로 최대 50개의 카트리지를 제작할 수 있습니다. 각 카트리지는 1회 사용 분량입니다. 카트리지 제작 후, 금 입자가 효율적으로 추진되는지 확인하기 위해 카트리지를 테스트하십시오.

페트리 접시를 정사각형 모양의 파라필름(paraform)으로 감쌉니다. 그다음 헬륨 압력을 150에서 200 PSI 사이로 설정하고, 새로 제작한 카트리지를 파라필름 사각형 위로 발사합니다. 파라필름 위에 나타나는 희미한 금 입자들을 관찰합니다.

헬륨 압력에 따라 서로 다른 양의 금 입자가 파퓸(parfum) 위로 추진될 수 있습니다. 하지만 유의미한 차이가 없다면, 충돌 시 더 낮은 압력을 선택하십시오. 이 테스트는 각 샷 과정에서 커버되는 영역 또한 나타냅니다.

양파 조직을 준비하려면, 깨끗하고 날카로운 면도날을 사용하여 커다란 황양파의 겉껍질을 벗겨냅니다. 4~5층 깊이로 2 x 8 cm 크기의 직사각형 영역을 절개합니다. 직사각형 모양의 양파 조직을 꺼낸 후 바깥쪽 두 층은 버립니다.

양파의 남은 층들을 약 1.5 centimeter 정사각형 모양으로 자릅니다. 3 mm 여과지 원형 조각들이 들어 있는 Petri 접시에 양파 조각들을 놓습니다. 멸균수로 적신 후 Petri 접시의 덮개를 닫습니다.

양파 조각들이 입자 충격 준비가 되었습니다. 먼저, 흰색 원형 카트리지 홀더에 카트리지를 장착하십시오. 서로 다른 플라스미드 컨스트럭트가 들어 있는 카트리지를 각각 다른 카트리지 홀더에 장착합니다. 각 카트리지 홀더에는 12회의 샷을 위해 최대 12개의 카트리지를 장착할 수 있습니다.

여기에서는 세 가지 서로 다른 홀더를 장착합니다. 첫 번째 홀더에는 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래의 강력하고 구성적인 프로모터인 35 S-G-F-P-A를 포함하는 카트리지가 들어 있습니다. 이 플라스미드는 양성 대조군으로 사용됩니다.

두 번째 홀더에는 동일한 양의 S-E-U-N-Y-F-P와 L-U-H-C-Y-F-P가 포함된 실험용 카트리지를 장착합니다. 세 번째 카트리지 홀더에는 puck spine 벡터와 LUH puck spice가 동일한 몰 농도로 혼합된 카트리지를 장착합니다. 이는 음성 대조군으로도 사용됩니다.

배터리와 새 배럴 라이너를 Helios 유전자 총에 삽입하십시오. 배럴 라이너와 유전자 총 모두에 각각의 O-링이 장착되어 있는지 확인하십시오. 다음으로, 카트리지 홀더의 숫자 12 표시가 유전자 총의 상단을 향하도록 하여 빈 카트리지 홀더를 유전자 총에 삽입하십시오.

카트리지 홀더를 한두 번 전진시켜 제대로 삽입되었는지 확인합니다. 그런 다음 건을 헬륨 탱크에 연결하고 압력을 150에서 200 PSI 사이로 조절합니다. 귀 보호구를 착용한 상태에서 트리거를 당기면서 측면 버튼을 눌러 건을 여러 번 발사합니다. 빈 카트리지 홀더가 장착된 상태에서 건을 발사하면 건 챔버 내부가 세척되고 압력이 안정되었는지 확인할 수 있습니다.

DNA를 발사하기 전, 양파 조각을 발사하여 배경 형광에 대한 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. DNA가 코팅된 금 입자를 발사하려면 빈 카트리지 홀더를 제거하고 양성 대조군이 들어 있는 첫 번째 로드된 카트리지 홀더를 삽입하십시오. 발사하려는 카트리지가 카트리지 홀더의 바닥에 위치하도록 카트리지 홀더를 전진시키십시오.

이제 양파 조각을 빈 페트리 접시 중앙에 놓되, 양파의 가장 안쪽 층이 위를 향하게 하십시오. 유전자 총의 배럴 라이너를 페트리 접시 위에 올리고 총을 발사합니다. 다음 카트리지로 이동하여 다른 양파 조각에 발사하십시오.

양파 조각 4~5개를 처리할 때까지 이 단계를 반복하십시오. 각 양파 조각은 처리 후 단 한 번만 조사합니다. 조사된 양파 조각을 습윤한 3 mm 필터 페이퍼가 들어 있는 페트리 접시로 옮겨 실험용 카트리지를 조사하십시오.

카트리지를 Holden으로 교체하십시오. 둘째, 오염을 방지하기 위해 배럴 라이너를 교체하는 것을 잊지 마십시오. 양성 대조군을 위해 방금 보여드린 것과 같이 양파 조각 4~5개를 촬영하십시오.

그 다음, 음성 대조군 DNA가 포함된 3번 Holden 카트리지로 교체합니다. 그리고 다시 양파 조각 4~5개를 분사합니다.

오염을 방지하기 위해 배럴 라이너를 교체하십시오. 조사(bombardment) 후, 양파 조각이 들어 있는 페트리 접시를 덮개로 덮으십시오.

건조를 방지하기 위해 파라필름으로 감쌉니다. 양파 조각을 실온의 암소에서 16~48시간 동안 배양합니다. 충격 처리가 완료되면 가스를 끄고 압력을 해제한 후, 헬륨 탱크에서 유전자 총을 분리하고 배럴 라이너의 나사를 풀어 카트리지 홀더와 사용한 카트리지를 제거합니다.

마지막으로, 카트리지 홀더와 배럴 라이너를 비누물이 담긴 비커에 담근 후 20분 동안 초음파 세척하십시오. 그 후, 물로 헹구어 모든 비누 잔여물을 제거하십시오.

70% ethanol에 1시간 동안 담근 후 페이퍼 타월로 건조합니다. 입자 총격 후 16~20시간이 지나면 양파 조각을 관찰합니다. 총격 처리한 양파 조각을 실온에서 16~20시간 동안 배양한 후, 평편한 끝단을 가진 핀셋을 사용하여 양파의 내부 표피에서 단일 세포층을 천천히 벗겨냅니다.

이 층은 포격 시 총구와 직접 마주하는 층입니다. 박리된 층을 슬라이드 글라스 위의 물 한 방울 위에 올리고 커버 슬립으로 덮으십시오. 이때 기포가 최소화되도록 주의하십시오.

여기에 제시된 zes axio observer, point Z one과 같은 형광 현미경을 사용하여 현미경의 명시야 상태에서 GFP 또는 YFP 형광을 관찰하십시오. 먼저 세포가 살아 있는지 확인하기 위해 세포질 유동을 확인하십시오. 확인 방법은 다음과 같습니다.

슬라이드를 명시야 조명에 몇 분 동안 노출시켜 양파 조직을 가온한 후, 이동하는 플라스미드를 관찰하십시오. 세포질 유동(cytoplasmic streaming)은 항상 쉽게 관찰되는 것은 아니므로, 명확하게 보이지 않더라도 낙담하지 마십시오. 형광 검출을 위해서는 GFP 또는 YFP에 적합한 여기 및 검출 필터를 사용하십시오. 또한, 형광 플라스미드가 아닌 플라스미드로 촬영한 양파 조각인 음성 대조군도 확인하십시오.

손상된 세포, 잔해 및 양파에서 옅은 노란색 신호가 나타날 수 있습니다. 또한, 지속적으로 발현되는 형광 리포터를 포함하는 플라스미드인 양성 대조군을 확인하십시오.

GFP 형광은 모든 세포가 아닌 일부 세포에서만 관찰됩니다. 기포 또한 배경 형광을 유발할 수 있습니다. 양파 표피 세포에서 GFP 신호가 확인되면 카트리지, 양파 조직 및 유전자 총 발사가 적절하게 준비되고 실행되었음을 의미합니다.

여기 35 SGFP 양성 플라스미드에서 관찰되는 강한 형광이 나타나 있습니다. 강한 형광은 핵과 세포질 모두를 포함하여 세포 전체에서 관찰됩니다. 명시야 이미지를 통해 세포와 핵의 해당 윤곽을 확인할 수 있습니다.

모든 세포가 형질전환되는 것은 아닙니다. Seuss, NYFP 및 L-U-H-C-Y-F-P의 실험적 조합을 양파 세포에 폭격(bombard)했을 때 양파 세포 핵에서 YFP 형광 신호가 검출되었으며, 이는 Seuss NYFP와 L-U-H-C-Y-F-P가 in vivo에서 상호작용함을 나타냅니다. 하지만, 이러한 상호작용에 의해 매개된 형광은 양성 대조군인 35 SGFP 매개 형광보다 현저히 약합니다.

또한, SEUS 및 LUH 전사 인자는 핵에 국소화되어 있습니다. 따라서 YFP 형광은 핵에서만 관찰됩니다. 또한, 형광 세포의 수는 35 SGFP 양성 대조군보다 현저히 적습니다.

이는 B FFC가 두 파트너 플라스미드가 동일한 양파 세포 내에서 모두 발현될 때만 작동하기 때문입니다. 음성 대조군에서 예상되는 바와 같이, puck spine, 벡터 및 L-U-H-C-Y-F-P의 혼합물이 포함된 3번 카트리지 홀더로 입자 총 조사를 실시한 양파에서는 형광 신호가 검출되지 않았습니다. 지금까지 BioRad Helios 유전자 총 시스템을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위해 양파 세포에 입자 총 조사를 수행하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때, 적절한 양성 및 음성 대조군을 사용하는 것이 중요하며, BIFC 형광은 신호가 더 약하고 형광 세포의 수가 더 적을 수 있다는 점을 유의하십시오. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.