Bimolecular 형광 Complementation

본 실험의 목적은 세포 내에서 두 단백질의 상호작용 여부를 정의하고, 해당 상호작용 부위의 특성을 규명하는 것입니다. 먼저, 관심 대상인 두 단백질을 인코딩하는 발현 벡터를 세포에 transfection하며, 이때 한 단백질은 분절된 형광 단백질의 N-말단에 융합되고 다른 단백질은 분절된 형광 단백질의 상보적인 C-말단에 융합됩니다. transfection된 세포가 배양액 내에서 형광 신호를 나타낼 때까지 기다린 후, 이미징 및 immuno blotting을 통해 단백질 복합체를 시각화합니다.

다음으로, 수집된 이미지를 Image J와 같은 이미징 소프트웨어로 내보냅니다. 제어된 실험에서 세포당 평균 형광 강도를 정량화하기 위해, BIFC 결과는 단백질-단백질 상호작용과 이러한 복합체의 국소화를 보여줄 수 있으며, 예를 들어 스캐폴드 단백질의 SH3 도메인과 PI3KC2β의 프롤린 풍부 도메인의 교차와 같은 사례가 이에 해당합니다. 공국소화(colocalization), 면역침강법(immunoprecipitation) 및 FRET과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, BiFC를 통해 세포 내의 더 약하고 일시적인 상호작용의 공간적 국소화를 확인할 수 있다는 점입니다. 또한, 이 방법은 FRET에서 볼 수 있는 것과 같은 광범위한 이미지 후처리가 필요하지 않습니다.

이 방법은 단백질 X와 Y가 상호작용하는지, 그리고 상호작용한다면 이 복합체가 세포 내 어떤 특정 구획에 위치하는지와 같은 신호 전달 분야의 핵심 질문들을 해결할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 생검 시료 발현을 위한 적절한 구성을 선택하지 않아 어려움을 겪곤 합니다. 관심 있는 태그 단백질의 경우, 우선 BIFC 융합 단백질에 사용할 여러 형광체 중 하나를 선택하는 것부터 시작하십시오.

Venus의 아미노 말단과 카르복시 말단은 37 °C에서 복합체를 형성할 수 있는 반면, Y-F-P-B-I-F-C 단편은 30 °C에서의 사전 배양이 필요하다고 가정하십시오. BIFC 단편의 결합이 표적 단백질의 기능에 어떤 영향을 미칠지 고려하여 표적 단백질에 태그를 추가하기 위한 발현 벡터를 설계하십시오. 예를 들어, RAs 패밀리와 GTP α들은 카르복시 말단에서 지질 수식이 이루어지므로, 이 수식을 방해하지 않고서는 해당 말단에 태그를 붙일 수 없습니다.

형질전환 조건을 결정하기 위해 항상 예비 실험을 수행하십시오. 또한, 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 신호가 발현되는 최적의 시간을 확인하십시오. 그 후, western blot 분석을 수행하여 컨스트럭트(construct)들이 동일하게 발현되었는지 확인하십시오.

중요한 점은, 각 샘플 플레이트에 대해 BIFC 단편의 추가가 표적 단백질의 세포 내 국소화를 변화시키지 않았는지 확인하기 위해 HA 또는 flag 태그에 대한 면역 염색을 수행하는 것입니다. 1.3 times 10의 다섯 개 세포를 각각 하나의 유리 바닥 배양 플레이트와 6-웰 플레이트의 두 웰에 분주하고, 37 degrees Celsius 인큐베이터에서 하룻밤 동안 세포를 안정화합니다. 다음 날, 리포펙틴(lipofectamine) 또는 기타 선호하는 방법을 사용하여 transfection용 DNA를 준비합니다.

먼저, transfection 대조군으로 사용하기 위해 DNA를 250 µL의 serum free DMEM에 희석합니다. 전체 BIFC DNA 양의 1/50에 해당하는 CFP를 첨가합니다. 이제 DNA 1 µg당 10 µL의 lip을 사용하는 비율로, lip을 250 µL의 serum free DMEM에 희석합니다.

DNA와 리포좀 희석액을 혼합하고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 세포를 따뜻한 무혈청 DMEM으로 두 번 헹굽니다. 각 글라스 바텀 플레이트 또는 6웰 디쉬의 웰에 무혈청 DMEM 2 mL를 넣습니다.

그런 다음 각 형질전환 혼합물을 유리 바닥 디쉬 하나와 6-well 플레이트의 웰 두 개에 균등하게 나누어 넣고, 세포를 37 °C에서 5시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 형질전환 배지를 제거하고 10% FBS가 포함된 완전 DMEM 배지로 교체합니다.

관심 단백질의 필요한 발현 수준을 얻기 위해 파일럿 실험에서 결정된 시간 동안 세포를 배양합니다. 에피 형광 현미경으로 형질전환된 세포를 관찰하여 양성 대조군이 형광을 나타내는지 확인합니다. 살아있는 세포 이미징을 위해 PBS로 세포를 세 번 헹굽니다.

지시약 색소가 포함되지 않은 배지에 세포를 넣으십시오. 고정된 세포를 이미징하는 경우, 2% para formaldehyde를 첨가하고 10분 동안 얼음 위에 두십시오.

그 후 세포를 PBS로 3회 세척하고 1 mL의 PBS를 채운 뒤 4 °C의 암소에 보관하며, 6-well dish 내의 세포를 즉시 용해합니다. Western blot 분석을 위해, 용해된 세포가 이미지 캡처 세포를 대표할 수 있도록 모든 세포를 동시에 준비하는 것이 중요합니다. Western blot을 수행하여 태그 단백질이 동등한 수준으로 발현되었는지 확인하십시오.

공초점 현미경으로 세포를 이미징할 때는 샘플 간의 형광 강도를 비교할 수 있도록 실험 전 과정 동안 설정을 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 픽셀이 포화되지 않은 개별 세포를 이미징하십시오. CFP가 형질전환 대조군으로 포함되었으므로, BIFC 신호를 분석할 때는 CFP 양성 세포만 선택하십시오.

Image J와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형광을 정량화하십시오. Image J에서 이미지 파일을 엽니다. Analyze의 Set Measurements로 이동하십시오. Measurements 상자에서 Area와 Mean Gray Value 체크박스를 선택하십시오. 이 예시에서는 정맥 이미지가 녹색으로, CFP 이미지가 빨간색으로 의사 색상(pseudo color) 처리되었음에 유의하십시오.

자유 선택 도구(freehand selection tool)를 사용하여 CFP 채널에서 세포 전체의 가장자리를 따라 외곽선을 그린 후, 이 외곽선을 그대로 유지합니다. YFP 채널로 전환합니다. 분석(analyze) 메뉴로 가서 평균 회색값(mean gray value)을 측정하며, 이는 각 이미지에서 세포당 평균 형광 강도를 나타냅니다.

세포가 포함되지 않은 영역의 YFP 채널에 원을 그립니다. 이 영역의 측정값을 배경값으로 설정합니다. 각 이미지에서 배경값을 뺍니다.

마지막으로, 세포 집단의 평균 형광 강도를 계산하려면 한 샘플에서 촬영된 모든 세포의 평균 등급 값에서 배경값을 뺀 값의 평균을 구합니다. 이상적으로는 3회의 실험에 걸쳐 60개의 세포를 정량화합니다. 다중 도메인 스캐폴딩 단백질 intersecting은 새로운 2급 PI 3 kinase인 PI3K-C2β의 조절을 통해 신경세포의 생존을 조절합니다. SH3 도메인을 가진 intersecting은 PI3K-C2β의 아미노 말단 프롤린 풍부 영역과 상호작용합니다. VN 태그가 붙은 intersecting과 VC 태그가 붙은 PI3K-C2β를 형질전환시키면 YFP 채널에서 형광 신호가 나타나며, 이는 복합체 형성을 나타내는 녹색으로 가색 처리됩니다.

여기서 빨간색으로 가색 처리된 CFP는 형질전환된 세포를 표시하는 대조군으로 사용되었습니다. PI 3KC2β의 프롤린 풍부 도메인(proline-rich domain)의 돌연변이는 상호작용 단백질과 PI 3KC2β의 공동 침전을 방해하며, 이로 인해 BIFC 신호가 감소합니다. 이러한 BIFC 신호의 차이는 야생형과 PA PI 3K 단백질의 발현 차이로 인한 것이 아닙니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, BIFC 신호의 차이가 발현의 차이가 아니라 복합체 형성의 차이로 인한 것임을 확인하기 위해 적절한 대조군을 설정하고 단백질 발현을 확인해야 한다는 점을 유념하십시오.

이러한 복합체들 간의 서로 다른 친화도는 어느 정도인가와 같은 질문에 답하기 위해, 레지던트(residents) 상의 표면 플라스몬 공명(surface plasma)과 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다.