라이브 세포에 형광 단백질과 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기능을 정화의 Photoconversion

다음 실험의 전체적인 목적은 형광 단백질 M orange two andron을 이용한 이중 프로브 광학 하이라이팅을 통해 4가지의 개별 세포군 또는 세포 내 구획을 선택적으로 표지하는 것입니다. 이는 먼저 저강도의 488 nanometer 여기광으로 세포를 조사하여 모든 green drawn per 형광을 꺼짐 상태로 전환함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포를 고강도의 488 nanometer 여기광에 노출시키면 m orange 형광이 적색으로 광전환됩니다.

다음으로, 이중 형광을 활성화하기 위해 세포를 800 nanometer 이광자 여기(two photon excitation)에 노출시킵니다. 다시 한번, M Orange two와 drawn ppa를 이용한 이중 프로브 광학 하이라이팅을 통해 세포를 네 가지 뚜렷한 조합으로 라벨링할 수 있다는 결과가 도출되었습니다. 세포 소기관 분별법(subcellular fractionation)과 같은 기존 실험과 비교했을 때 이 절차의 주요 장점은 살아있는 세포에서 수행된다는 점입니다.

이 절차는 왜 인슐린 소낭의 아주 적은 부분만 분비되는지와 같이 베타 세포 생물학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차는 베타 세포 기능에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 예를 들어, 생체 내(in vivo) 암세포 추적 등이 있습니다. 형광 단백질 액적 샘플은 수상에 형광 단백질이 존재하는 O/W(oil-in-water) 에멀젼으로 구성됩니다.

현미경 관찰을 위해 이 에멀젼을 현미경 슬라이드와 22 millimeter 정사각형 커버 글라스 사이에 샌드위치 구조로 배치합니다. 이 절차를 시작하기 전, 현미경 슬라이드와 커버 글라스를 세척하고 소수성 제제로 코팅해야 합니다. 유리 기구를 아세톤으로 5분 동안 세척하여 깨끗하게 닦아냅니다.

세척 후, 유리 기구를 공기 중에서 건조시킵니다. 다음으로, 아세톤에 2% methyl trimethoxy silane 용액을 준비하고 유리 기구를 해당 용액에 2분 동안 코팅합니다. 코팅 후, 유리 기구를 용액에서 꺼내어 건조시킵니다.

그 다음 분무병에 담긴 70% ethanol로 유리 기구를 헹굽니다. 헹군 후, 유리 기구를 다시 공기 중에서 건조시키고 남아 있는 액체를 제거합니다. 가압 공기를 사용하면 코팅된 유리 기구를 최소 한 달 동안 보관할 수 있습니다.

초자 기구를 준비한 후, 이전에 E. coli에서 His-태그 단백질로 정제된 형광 단백질을 준비합니다. 정제된 단백질의 흡수 스펙트럼을 측정합니다. 0.1% bovine serum albumin이 포함된 pH 8의 Tris 완충 식염수(tris buffered saline solution)를 사용하여 광학 밀도가 약 0.1이 되도록 스톡 희석액을 준비합니다.

또한, 15 mL 원추형 튜브에 1-octanol과 Tris 완충 식염수를 1:1 비율로 섞어 10 mL를 준비하고 격렬하게 혼합합니다. 혼합 후 층 분리가 완료될 때까지 그대로 둡니다. 상층이 octanol 층이 되므로, 에멀젼을 만들기 위해 1-octanol 45 µL와 형광 단백질 5 µL를 에피오런 튜브(Eppendorf tube)에 분주합니다.

튜브를 몇 번 두드려 에멀젼 형성을 시작한 후, 초음파 세척기에서 30초 동안 튜브를 초음파 처리합니다. 그동안 초음파 처리 후 사용할 코팅된 현미경 슬라이드와 커버 글라스를 준비합니다. 에멀젼은 완전히 불투명한 상태여야 합니다.

튜브 중앙에서 에멀션을 4 µL 즉시 피펫팅하여 코팅된 현미경 슬라이드 위에 올리고, 코팅된 커버 글라스로 덮습니다. 에멀션은 현미경 슬라이드와 커버 글라스 사이에 고르게 퍼져야 합니다. 수 분 이내에 샘플이 안정화됩니다.

다음 절차는 공초점 레이저 주사 현미경에서 형광 단백질 광전환 실험을 설정하기 위한 일반적인 전략입니다. 이 절차는 정제된 단백질뿐만 아니라 살아있는 세포에도 적용할 수 있습니다. 본 실험에서는 정제된 m orange two 단백질이 포함된 액적 시료를 광전환 실험의 일반적인 시작점으로 사용합니다.

공초점 레이저 주사 현미경을 다음과 같이 설정합니다. 40 x 1.3 수치 구경의 오일 침수 렌즈와 512 by 512 픽셀의 이미지 크기를 사용하십시오. 픽셀 체류 시간은 6 µs로 설정하고, 줌은 4배로 지정하며, 핀홀 크기를 조정하여 Z 해상도를 3 µm로 맞춥니다.

초기 및 광전환 형광을 위한 두 개의 검출 채널과 광전환 채널을 설정하십시오. 561 nanometer 여기광을 사용하여 오렌지색 종을 관찰하고 570에서 630 nanometer 사이의 형광을 수집하십시오. 633 nanometer 여기광을 사용하여 광전환된 적색 종을 검출하고 640에서 700 nanometer 사이의 형광을 수집하십시오.

광전환 채널의 경우, 488 nanometer 레이저 라인을 선택하고 490에서 540 nanometer 사이의 형광을 수집하여 이미징합니다. 광전환 채널이 반드시 필요한 것은 아니나 유용하게 사용될 수 있습니다. 실험을 시작하려면, 검출 채널을 사용하여 초기 형광을 연속 스캐닝으로 이미징함으로써 최적의 이미지 품질을 위해 레이저 출력과 검출기 게인을 조정하십시오.

그다음 광전환(photo conversion) 채널을 활성화하고 낮은 레이저 출력을 선택하십시오. 타임랩스 시리즈 촬영을 시작하고, 초기 형광의 유의미한 퇴색(bleaching)이 관찰될 때까지 광전환 레이저 강도를 점진적으로 높이십시오. 초기 형광의 약 75%가 퇴색될 때까지 스캐닝을 계속하십시오.

다음으로, 광전환 채널을 비활성화하고 광전환된 형광을 위한 검출 채널을 활성화합니다. 낮은 레이저 출력에서 검출기 게인을 높게 설정하여 이미징을 시작합니다. 그런 다음 광전환 형광이 검출될 때까지 레이저 출력을 점진적으로 높입니다.

검출이 완료되면 레이저 출력과 검출 또는 게인을 조정하여 최적의 이미지 품질을 확보하십시오. 마지막으로, 광전환에 사용되는 레이저 출력과 지속 시간을 최적화하십시오. 레이저 출력을 높이면 광전환 속도가 빨라집니다.

하지만 레이저 출력이 너무 높으면 단백질의 광퇴색(photobleaching)이 일어납니다. 최적의 광전환 효율, 레이저 출력 및 지속 시간이 결정되면, 이러한 매개변수를 사용하여 표준 광퇴색 모듈 또는 광퇴색 후 형광 회복(FRAP) 모듈을 구성할 수 있습니다. 그렇게 되면 M orange two의 적색 이동(Redshift) 스펙트럼 특성 덕분에 더 이상 광전환 채널이 필요하지 않게 됩니다.

이는 이중 프로브 광학적 강조(dual probe optical highlighting)를 위해 녹색 광전환 형광 단백질인 PU와 결합하여 사용할 수 있습니다. 이중 프로브 광학적 강조를 시작하려면, 유리 바닥 매트-텍(glass bottom mat tech) 디쉬에서 HeLa 세포를 배양하고, 표준 Lipofectamine 2000 형질전환법을 사용하여 이미징 24시간 전에 형광 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 세포에 형질전환하십시오.

생존 세포를 공초점 레이저 주사 현미경에 올리고, 앞서 설명한 대로 M orange two 광전환을 위해 현미경을 설정합니다. 그 다음, DPA 광스위칭을 위해 현미경을 구성합니다. DPA는 488 nanometer 빛으로 여기되며, 그 형광은 M orange two 광전환 채널을 사용하여 이미징할 수 있습니다.

MPA 이미징 시에는 과도한 레이저 출력이 mpa의 불활성화를 유발할 수 있으므로 레이저 출력을 최소화해야 합니다. 800 nm 이광자 여기를 이용한 MPA 광활성화를 위한 채널을 추가하십시오. 이어서 광활성화 및 광불활성화 OFA 형광 이미징에 필요한 레이저 출력을 결정하십시오.

이 절차에서 가장 어려운 점 중 하나는 M orange의 광전환(photo converting) 없이 RPA를 불활성화하는 것입니다. 이는 두 사건이 동일한 파장에서 일어나기 때문입니다. 이를 방지하기 위해서는 광전환 과정을 세심하게 최적화하는 것이 매우 중요합니다.

레이저 출력 및 지속 시간: M orange two의 광전환과 PU의 불활성화가 모두 488 nm 광 여기 시 발생하므로 주의하십시오. M orange two의 유의미한 광전환 없이 PU를 불활성화해야 합니다. M orange two 광전환 및 DPA 광스위칭을 위한 파라미터가 설정되면 더 낮은 레이저 출력을 사용하십시오.

이중 프로브 광학 하이라이팅을 구현할 수 있습니다. 먼저 저출력 488 nanometer 여기광으로 전체 시야의 DPA 형광을 비활성화합니다. 그 다음 관심 영역을 선택하고 고출력 488 nanometer 여기광으로 m orange two를 전환합니다.

마지막으로, 관심 영역을 선택하고 800 nm 이광자 여기를 사용하여 DPA 형광을 활성화합니다. 형광 단백질 액적 샘플은 공초점 현미경 광전환 응용 프로그램을 설정하는 데 매우 적합합니다. 액적 샘플이 올바르게 준비되면, 액적들이 매우 균질하게 나타납니다.

하지만 커버 글라스를 사용하여 현미경 슬라이드를 코팅하지 않고 시료를 준비하면, 준비된 시료 내의 액적들이 유리 표면 중 하나에 눌리는 경향이 있습니다. 0.1%BSA가 없으면 형광 단백질이 하나의 수성 계면에 축적되는 경향이 있습니다. 형광 광전환 헤일로를 생성하는 것은 레이저 출력과 노출 시간에 결정적으로 의존합니다.

레이저 출력이 너무 높거나 노출 시간이 너무 길면 광퇴색(photobleaching)이 발생하여 광전환된 적색 형광이 감소합니다. M orange two와 PHO의 뚜렷한 스펙트럼 특성 덕분에 광전환 전에 두 프로브를 광학적으로 구분하여 강조할 수 있습니다. M orange two, histone H two B 및 DPA mito를 발현하는 세포는 핵에서 오렌지색 형광을, 미토콘드리아에서 녹색 형광을 나타냅니다. 낮은 출력의 488 nanometer 여기광으로 모든 형광을 껐을 때, M orange의 광전환은 최소한으로 일어납니다.

M orange two는 고출력 488 nm 여기를 통해 적색으로 광전환될 수 있습니다. M orange two가 광전환되면, 800 nm 이광자 여기를 사용하여 형광을 다시 켤 수 있습니다. 이중 프로브 광학 표적화를 통해 세포를 네 가지 서로 다른 방식으로 라벨링할 수 있습니다.

이 기술을 사용하면 네 가지 서로 다른 세포 집단을 특이적으로 표지할 수 있습니다. 보신 바와 같이, 이 절차에서 가장 어려운 부분 중 하나는 m orange를 광전환시키지 않고 MPA를 비활성화하는 것입니다. 이 기술을 숙달하면, 예를 들어 췌장 베타 세포에서 여러 집단을 추적하는 것과 같은 추가 실험을 이 시스템을 사용하여 수행할 수 있습니다.

이상입니다. 이번 프레젠테이션이 유용했기를 바라며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.