에서 다세포 행동을 기록 Myxococcus 산투스 Biofilms

다음 실험의 전반적인 목표는 재현 가능하고 정량화 가능한 결과를 생성할 수 있을 만큼 충분한 엄격함을 갖춘 저렴한 타임랩스 미세 영화 촬영 분석법을 개발하는 것입니다. 이는 저렴하고 재사용 가능한 실리콘 가스켓을 사용하여 아가로스 배지 플레이트 또는 현미경 슬라이드를 제작함으로써 달성됩니다. 다양한 배지 유형과 아가로스 농도에 걸쳐 이러한 플레이트 복합체가 일주일 이상 수분을 유지하고 충분히 산소가 공급됨을 보여주는 결과가 도출되었습니다.

또한, 타임랩스 마이크로 시네마토그래피는 시간이 오래 걸리는 과정이므로, 8대의 저가형 현미경을 사용하여 데이터 획득 속도를 높였습니다. 안녕하세요, 시라큐스 대학교 생물학과 Roy Welch 박사님 연구실의 Ryan Taylor입니다. 오늘은 저희 연구실에서 박테리아 바이오필름의 타임랩스 영상을 제작하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 이 절차를 통해 MTI 바이오필름의 다세포 행동을 연구할 것입니다.

그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 위해, clut 미터를 사용하여 하룻밤 동안 배양한 Occus sanus 혼합 배양액의 세포 밀도를 측정하십시오. 배양액 1 mL를 2.5 mL 원심분리 튜브에 옮긴 후, 동봉된 서면 프로토콜에 기술된 대로 박테리아를 펠릿화하고 세척한 다음 TPM 배지에 재현탁하십시오. 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 피펫팅과 볼텍싱을 수행하며, 이 과정에 시간이 다소 소요될 수 있습니다. 다음으로, 분석 배지인 TPM 50 mL에 aros 0.5 g을 첨가하십시오.

또한 0.5 g의 aros를 50 mL의 C-T-T-Y-E에 추가하며, 이는 멸균을 위해 오토클레이브로 멸균하는 영양 디스크 배지입니다. 그 후, 추적 분석(tracking assay)을 구축하는 동안 배지를 인큐베이터 또는 항온수조에서 55 °C로 유지합니다.

플레이트 복합체를 준비하여 먼저 화염 멸균기로 유리 현미경 슬라이드를 멸균합니다. 슬라이드 위에 0.5 millimeter 두께의 멸균된 실리콘 고무 가스켓을 올립니다. 가스켓에 의해 슬라이드 위에 형성된 웰에 C TT YE 배지 약 300 microliters를 피펫으로 분주합니다.

C-T-T-Y-E 배지 아가로 화염 멸균한 다른 슬라이드를 준비하여 C-T-T-Y-E 배지 아가 위에 비스듬히 놓습니다. 슬라이드를 비스듬히 놓으면 기포 형성을 방지할 수 있습니다. 슬라이드가 고정되면 미니 바인더 클립을 양쪽에 하나씩 사용하여 복합체를 함께 고정합니다.

클리핑된 복합체를 4°C에 두고 C-T-T-Y-E 배지 아가(agro)가 굳을 때까지 기다립니다. 이는 보통 약 5분 정도 소요됩니다. 아가가 굳으면 추적 분석(tracking assay)에 사용할 플레이트 복합체를 준비할 수 있습니다.

먼저 분석 복합체를 구성하기 위한 슬라이드를 준비하십시오. 각 복합체에 대해 두 개의 유리 현미경 슬라이드를 화염 멸균합니다. 슬라이드 중 하나 위에 오토클레이브 가스켓을 올려 분석 장치의 바닥을 형성합니다.

다른 슬라이드는 agros를 평평하게 펴고 지지 슬라이드로 사용하는 데 쓰입니다. 분석 시스템의 상단은 커버 슬립으로 덮습니다. 먼저 현미경 슬라이드를 라벨링 테이프로 감싼 후, 유리 커버 슬립을 화염 멸균하여 멸균된 슬라이드 위에 올립니다.

커버슬립이 깨지지 않도록 랩으로 감싼 슬라이드 지지대를 위로 밀어 올립니다. 핀셋을 사용하여 화염 멸균된 커버슬립 위에 오토클레이브 가스켓을 올립니다. 하단 슬라이드와 커버슬립 위의 가스켓을 아래로 눌러 유리와 밀착되어 밀봉되었는지 확인합니다.

그렇지 않으면 배지 어레이가 마를 수 있습니다. 슬라이드 가스켓과 커버 슬립 가스켓 어셈블리를 멸균된 면이 위로 향하도록 하여 따로 둡니다. 이때부터는 배지 어레이가 응고되어 영상 품질이 저하되는 것을 방지하기 위해 한 번에 하나의 복합체만 작업하십시오. 먼저 영양 디스크를 배치하는 것으로 시작합니다.

4 °C에서 영양 디스크 복합체를 꺼냅니다. 바인드 이클립스를 제거하고, 100 µL 유리 일회용 팁이 장착된 마이크로 샘플링 피펫을 사용하여 이제 응고된 C-T-T-Y-E 아가로를 노출시켜 슬라이드를 분리합니다. C-T-T-Y-E 배지 아가로에서 직경 1 mm의 영양 디스크를 제거하여 커버슬립의 가스켓으로 만들어진 웰에 넣습니다.

그 다음 인큐베이터에서 TPM 배지 아가로스를 꺼내고, 커버슬립의 가스켓으로 만들어진 웰(영양 디스크가 포함된 곳)에 300 µL를 피펫으로 분주합니다. TPM 배지 아가로스는 TPMSA 배지 아가로스를 평평하게 덮을 수 있도록 소복하게 쌓여야 합니다. 가스켓이 없는 화염 멸균된 슬라이드 하나를 TPM 배지 아가로스 위에 비스듬히 놓습니다. 슬라이드를 비스듬히 놓으면 기포 형성을 방지하는 데 도움이 됩니다.

양쪽에 미니 바인더 클립을 하나씩 사용하여 복합체를 함께 고정합니다. 클립으로 고정된 복합체를 4°C에 두고 배지가 굳을 때까지 기다립니다. 이 과정은 보통 약 5분 정도 소요됩니다.

배지가 굳으면, 복합체를 4°C에서 꺼냅니다. 바인더 클립을 제거하고 복합체의 끝부분을 쥐어짜 줍니다. 테이프로 감긴 슬라이드가 느슨해지면, 이를 분리하여 이후 사용을 위해 벤치 위에 둡니다.

그런 다음 핀셋 한 쌍을 쐐기처럼 사용하여, 커버슬립 가스켓 미디어 어레이 복합체를 지지 슬라이드에서 분리하고 지지 슬라이드는 폐기합니다. 커버슬립 가스켓 복합체를 분리할 때 지렛대 동작을 사용하지 마십시오. 이는 커버슬립이 파손되거나 미디어 어레이가 지지 슬라이드에 달라붙는 결과를 초래할 수 있기 때문입니다.

지지 슬라이드를 제거한 후, 커버슬립 가스켓 미디어 어레이 복합체를 가스켓 면이 위로 향하게 하여 테이프를 감은 슬라이드 위에 놓습니다. 이 복합체를 버너 옆에 두어 새로 노출된 미디어 어그로스 표면에서 모든 가시적인 수분이 증발하도록 합니다. 미디어 어그로스를 1분 이상 건조시키지 마십시오.

이는 M Zant의 군집 행동에 영향을 줄 수 있으므로, 새로 준비된 분석 복합체에 세포를 도말하십시오. 커버 슬립 가스켓 미디어 agros 복합체에서 과잉 수분이 증발하면, 미디어에 도포하기 위해 농축된 세포 0.5 µL를 흡입하십시오. 미디어 agros에 접근하기 전에 피펫 팁을 가볍게 눌러주십시오.

피펫 팁 끝에 세포 방울이 맺히면, 팁이 배지 아가로스에 닿지 않고도 세포를 더 쉽게 분주할 수 있습니다. 아가로스 표면의 함몰은 swarm의 mz 거동을 변화시킬 수 있습니다. 피펫을 수직으로 내려 매립된 영양 디스크에서 약 1 mm 떨어진 지점에 세포를 분주하십시오.

그 다음 피펫을 수직으로 곧게 들어 올립니다. 이렇게 하면 세포 무리가 원형을 유지하게 됩니다. 세포를 도말한 후, 복합체를 버너 옆에 두고 세포 반점이 20초 이내로 건조되도록 합니다.

건조 후, 복합체 하단을 형성하는 슬라이드 가스켓 어셈블리를 커버의 가스켓과 정렬합니다. 복합체 상단을 형성하는 가스켓 미디어 아크로 셀 복합체를 밀어 넣습니다. 가볍게 눌러 밀봉합니다.

응결 현상을 방지하기 위해 킴와이프(kim wipe)로 슬라이드와 커버슬립의 표면을 닦아 잔여물을 제거하십시오. 슬라이드를 아래로, 커버슬립을 위로 향하게 하여 세척 직후에 복합체를 가열된 현미경 스테이지 위에 놓으십시오. 응결이 형성된 경우, 이미지 획득 소프트웨어를 시작하기 전에 슬라이드 복합체를 가열된 스테이지 위에 몇 초간 그대로 두십시오.

영상을 준비하기 위해 현미경에서 2배, 4배 또는 10배의 적절한 대물렌즈를 선택하십시오. 카메라와 현미경의 전원을 켜고 조명 수준을 확인하여 빛이 너무 강하지 않은지 확인하십시오. 컴퓨터를 부팅하고 이미지 획득 프로그램을 실행하십시오.

라이브 이미지 창을 클릭하고 현미경의 초점을 맞춥니다. 이미지는 여기에서 보여지는 것과 유사하게 나타납니다. 이미지 획득을 시작합니다.

배지 아가(agar)가 가라앉으면서 초점이 어긋나는 경향이 있으므로, 첫 한 시간 동안은 정기적으로 초점을 확인하십시오. 이미지 획득이 완료되면, 획득한 이미지를 저장소로 전송하십시오. 90% ethanol에 하룻밤 동안 담가 슬라이드 복합체를 분해하거나, 재사용을 위해 가스켓을 TOLA 처리하십시오.

이 타임랩스 영상은 여기에 설명된 추적 분석(tracking assay)을 거친 em을 보여줍니다. 캡처 속도는 20배 배율에서 분당 1장의 이미지이며, 재생 속도는 초당 60장의 이미지입니다. 이 타임랩스 영상은 세포의 1%가 GFP를 발현하고 있는 eant 세포 집단을 보여줍니다.

교차 위상차(phase contrast) 이미지와 형광 이미지를 병합하여 영상을 제작하였습니다. 분석은 1% Aros가 포함된 C-T-T-Y-E에서 수행되었으며, 100x 배율에서 분당 1장의 이미지로 촬영하였습니다. 이 타임랩스 영상은 M Anthes의 글라이딩 운동성(gliding motility)을 보여줍니다.

이 분석은 1% Aros가 포함된 C-T-T-Y-E에서 수행되었습니다. 캡처 속도는 100배 배율에서 분당 1장의 이미지입니다. 이 타임랩스 영상은 P OSA의 트위칭 운동성(twitching motility)을 보여줍니다. 이 분석은 1% Aros가 포함된 LB에서 수행되었으며, 캡처 속도는 분당 1장의 이미지입니다.

20배 배율에서 재생 속도는 초당 60프레임입니다. 이 타임랩스 영상은 Smar 센서의 군집 운동성을 보여줍니다. 이 분석은 LB 및 1% Aris에서 수행되었으며, 캡처 속도는 분당 1프레임입니다.

20배 배율에서 재생 속도는 초당 60프레임입니다. 이 타임랩스 영상은 EGT의 슬라이딩 운동성을 보여줍니다. 이 분석은 0.5% agarose 캡처 속도가 분당 1프레임인 LB 배지에서 수행되었으며, LV 내 0.5% agarose의 취약성으로 인해 20배 배율에서의 재생 속도는 초당 120프레임입니다.

이 분석법에서는 그림 1 B에 나타난 더 큰 가스켓을 사용합니다. 지금까지 박테리아 바이오필름의 타임랩스 영상을 제작하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 일관된 결과를 얻기 위해 서두르지 말고 가능한 한 정밀하게 작업하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.