시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

다음 실험의 전체적인 목표는 비디오 타임랩스 현미경을 사용하여 세포의 이동을 실시간으로 정량적으로 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 6-웰 배양 플레이트에 콜라겐을 코팅한 다음, 코팅된 플레이트에 대상 세포를 저밀도로 파종합니다. 두 번째 단계로, 피펫 팁을 사용하여 플레이트에 상처를 만들어 세포가 이동할 수 있는 충분한 공간을 확보합니다.

다음으로, 온도를 제어하는 시스템을 사용하여 현미경을 설정하고 일정한 간격으로 이미지를 캡처함으로써 이동하는 세포를 실시간으로 지속적으로 모니터링합니다. 최종적으로, 파티클 트래킹 프로토콜을 사용하여 실험군 세포와 대조군 세포의 평균 속도 및 총 변위의 차이를 평가합니다. 회피 챔버 이동 분석(avoidant chamber migration assay)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 최종 시점의 정량적 이동 측정에 기반하지 않는다는 점입니다.

대신, 이 방법은 다양한 파라미터를 지속적으로 모니터링하고 계산할 수 있게 해줍니다. 이러한 방식은 특정 유전자나 약물이 종양 세포 이동에 어떤 영향을 미치는가와 같이 암 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 실험 수행 2일 전에 opti media에 희석한 콜라겐 1.5 milliliters를 6-well culture plate의 각 웰에 넣고, 실험 전날에 4 °C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다.

관심 세포를 웰당 2 mL의 FBS가 포함된 DMEM에 다시 현탁하여 콜라겐 ENC가 코팅된 플레이트의 각 웰에 옮기고, 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 실험 당일, 피펫 팁을 사용하여 하룻밤 동안 배양된 세포에 상처를 내고, 각 웰을 PBS로 세척하여 상처로 인해 발생한 잔해를 제거합니다.

헹궈낸 웰에 FBS가 포함된 DMEM을 추가한 후, 현미경으로 관찰하여 깨끗한 상처 부위가 형성되었는지 확인합니다. 현미경 카메라와 라이브 셀 이미징 장치를 켠 다음, 플레이트를 현미경 스테이지 위에 배치합니다. 새 라이브 셀 환경 제어 챔버로 플레이트를 덮고, 온도 조절기의 온도를 37°C로, 이산화탄소 농도를 5%로 설정합니다. 이제 메뉴 바에서 슬라이드 북 소프트웨어를 엽니다.

원형 안의 F 버튼을 클릭하여 초점 제어를 선택하십시오. 대물렌즈 상자에서 드롭다운 창을 사용하여 대물렌즈를 정의하십시오. 필터 세트 상자에서 광로를 I 피스로 유도하도록 설정을 선택하십시오. 명시야 조명(Bright Field Illumination)에 적합한 필터를 선택한 다음, open Bright를 클릭하십시오.

명시야 셔터를 엽니다. 이제 터렛에서 명시야 필터를 선택하고 접안렌즈를 통해 샘플을 관찰하여 적절한 시야를 찾고 샘플의 초점을 맞춥니다. 그런 다음 필터 터렛을 이동하여 광로를 카메라로 변경합니다. 슬라이드 북 소프트웨어에서 이미지를 캡처하려면 초점 제어(focus control)를 클릭하고 XY를 선택하여 접안렌즈를 통해 다양한 위치를 선택한 다음, 설정 지점(set point)을 클릭하여 각 위치를 고정합니다.

이미지 캡처를 위해, 화면에 표시되는 카메라 이미지의 초점을 수동으로 미세 조정하고, 초점 제어 창의 도구를 사용하여 스테이지의 Z 위치를 조정하십시오. 최상의 결과를 얻으려면, 초점 맞추기에 도움이 되도록 플레이트 접촉면 근처의 평평한 세포 돌출부에 초점을 맞추십시오. 슬라이더를 사용하여 노출 시간을 초점 조절에 적절한 범위로 조정하십시오.

여러 개의 XY 위치가 선택된 경우, 포커스 제어를 선택하여 각 개별 위치의 초점을 조정하십시오. 그 다음 xy를 선택하고 visit point를 선택하십시오. slide book의 메뉴 바에서 카메라 그래픽을 선택하고, capture type을 선택한 후 time lapse를 선택하여 실험 시간을 설정하십시오.

드롭다운 메뉴에서 한 시점의 시작부터 다음 시점의 시작까지의 원하는 지연 시간을 입력하십시오. 간격 필드에서 세 번째 필드는 수동으로 입력된 값으로부터 자동으로 계산됩니다. 다중 XY 캡처(multiple XY capture) 항목에서, XY 위치가 두 곳 이상인 실험의 경우 다중 지점 목록(multi-point list)을 선택하십시오.

마지막으로, 저장할 파일 이름을 지정하고 캡처 컨트롤(capture control)로 이동하여 어드밴스드(advanced)를 선택한 후 스풀(spool)을 선택합니다. 그런 다음 각 시점마다 메모리에 캡처하고 스풀 파일로 저장하십시오. 이미지 클릭부터 시작합니다.

슬라이드 북 메뉴 바에서 드롭다운 메뉴의 import를 선택한 다음, slide book spool을 클릭합니다. 다양한 영역과 시점에서 마이그레이션 실험을 통해 생성된 원하는 슬라이드 북 파일들을 선택합니다. 첫 번째 파일을 열고, 메뉴 바에서 mask를 선택한 후 드롭다운 메뉴에서 particle tracking protocol을 선택합니다.

입자 추적(particle tracking) 메뉴에서 수동 입자 추적 프로토콜을 선택합니다. 시작 및 종료 시점이 표시된 창이 나타납니다. 무작위 이동을 분석하려면 마스크(mask)를 선택한 다음 입자 추적 프로토콜을 선택하십시오. 다시, 객체 중심의 좌표를 결정하기 위해 영역 중심(center of area)을 선택합니다.

그 다음 track 및 continue를 클릭합니다. 이제 변위 및 평균 속도와 같이 각 경로에 대해 원하는 통계 항목을 선택하십시오. 여기에서 보는 바와 같이, calculate를 클릭하여 통계치를 확인합니다.

속도로 정량화한 무작위 이동 분석의 예가 이 상자에 나타나 있습니다. Whiskers 그래프를 보면, 본 실험에서 종양 억제 유전자가 녹다운된 M-D-A-M-B 2 31 세포의 평균 속도가 증가했음을 알 수 있습니다. 대조군인 M-D-A-M-B 2 31 세포와 비교하여, 첫 번째 그림에 제시된 세포의 무작위 이동이 세포 변위 관점에서 분석되었습니다.

다시 한번, 전체 종양 억제 유전자 넉다운 그룹은 대조군 M-D-A-M-B 2 31에 비해 세포 변위가 증가했습니다. 이 타임랩스 비디오 현미경 영상의 세포들은 대조군 MDA MB 2 31 세포로, 밤새 콜라겐 위에 안착시켰습니다. 그 후 무작위 이동 과정 동안 총 18시간 동안 1시간 간격으로 이미지를 촬영했습니다.

시간이 지남에 따라 세포들이 원래 위치에서 어떻게 멀어지는지 관찰하십시오. 이 영상에서는 콜라겐 상에 하룻밤 동안 파종한 후 M-D-A-M-B 2 31 테스트 세포의 이동을 기록하고 분석하였습니다. 테스트 세포가 이전 영상의 대조군 세포보다 더 활발하게 이동한다는 점에 유의하십시오.

이 절차 이후, 암 전이 발생 후 세포의 역할은 무엇인가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 세포 침습(cell invasion) 및 dynas와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 분리된 암 세포주를 사용하여 세포 이동을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.