Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

수지상 돌기 가시는 시냅스 입력을 받는 뉴런 수지상 돌기의 막 돌출부입니다. 가시의 길이 연장, 수축, 출현 또는 소멸은 특정 신경 활동 패턴으로 인해 발생하는 신경망 기능의 변화에 반응하여 일어납니다. 이러한 현상을 피질 가소성이라고 하며, 이를 통해 수지상 돌기 가시의 형태학적 변화를 관찰할 수 있습니다.

살아있는 동물에서, 마우스의 두개골에 이미징 플레이트를 부착합니다. 두개골의 일정 영역을 외과적으로 얇게 만든 후, 저배율 및 고배율 이미지를 획득해야 합니다. 이후 일정 시간이 지난 시점에서 해당 영역을 다시 이미징합니다.

결과를 통해 얇은 두개골 표본 준비법을 사용하여 여러 시점에서 수지상 돌기 가시의 형태를 명확하게 시각화할 수 있음을 확인하였습니다. 또한 가시 형태는 매우 가소성이 높으며, 구조적 변화뿐만 아니라 수지상 돌기 가시의 생성과 소멸이 나타남을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 신경생물학 및 해부학과의 Anaya Maka 연구실 소속 Emily Kelly입니다.

오늘은 핀스(fins)라고 불리는 전처리를 거친 후 생쥐의 시각 피질을 만성적으로 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 수지상 돌기 가시(dendritic spine)의 교체를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

무균 수술을 위한 도구들을 멸균하여 절차를 시작합니다. 그다음 70% ethanol을 사용하여 작업 공간을 멸균하고, 수술 표면을 깨끗한 드레싱으로 덮습니다. 발가락 꼬집기 반응을 테스트하여 펜타닐 칵테일로 마취된 마우스의 마취 깊이를 모니터링합니다. 여기에 표시된 마우스는 GFP가 발현된 A-G-F-P-M 형질전환 마우스입니다.

5층의 파라메탈 세포(parametal cells)는 가지돌기 돌기를 표면층으로 뻗습니다. 체온을 37.5°C로 유지하기 위해 동물을 가열 패드 위에 놓고 부착된 직장 온도계로 모니터링하십시오. 그런 다음 가위(또는 도구)를 사용하여 안구의 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포하십시오.

귀 뒤쪽부터 눈까지 생쥐 머리 뒷부분의 털을 제거합니다. 그런 다음 70% ethanol을 도포하여 동물의 머리 윗부분을 세척하고, 이어서 Betadine scrub과 Betadine solution으로 세척합니다. 귀 뒤쪽에서 시작하여, 영상 촬영 예정인 반구에 따라 정중선의 오른쪽 또는 왼쪽을 따라 눈 방향으로 LCU 절개를 실시하고, 피부를 수술 부위에서 바깥쪽으로 젖혀 고정합니다.

나중에 미세 핀셋을 사용하여 봉합해야 하므로 피부를 제거하지 마십시오. 피부를 조심스럽게 들어 올려 관심 부위에서 멀어지게 당깁니다. 깨끗한 핀셋을 사용하여 노출된 두개골 부위에서 골막을 부드럽게 긁어 제거합니다.

10% fair chloride를 두개골에 소량 도포하여 골막을 완전히 건조시키고, 골막이 완전히 제거되었는지 확인합니다. 두개골을 완전히 건조시키는 것이 중요합니다. 접착제가 적절히 부착될 수 있도록, 미세 수술용 칼로 건조된 골막을 부드럽게 긁어냅니다.

다음으로, 스테인리스 스틸 헤드 플레이트의 이미징 창 주변에 Sano 아크릴 접착제를 얇게 도포하고 플레이트를 두개골에 부착합니다. 면봉의 나무 끝부분을 사용하여 이미징 창의 내부 이음매에 접착제를 도포하며, 이미징 플레이트와 두개골의 곡면 사이의 모든 틈새가 충분히 채워졌는지 확인합니다. 창 내부에 접착 촉진제를 한 방울 떨어뜨립니다.

그 후 남은 접착제를 빠르게 닦아냅니다. 접착제가 완전히 마를 때까지 기다립니다. 0.7 millimeter 스테인리스 스틸 버(burr)가 장착된 치과용 드릴을 사용하여 영상 윈도우 내의 두개골을 얇게 깎아내기 시작합니다.

두개골에 과도한 열이 발생하는 것을 방지하기 위해 0.9% 멸균 식염수를 간헐적으로 도포하며 교대로 드릴링합니다. 두개골 표면을 가로질러 짧게 쳐내는 동작을 통해 두개골에 4x4 mm 크기의 창을 얇게 냅니다.

치과용 드릴을 사용합니다. 뭉툭한 끝의 포셉으로 두개골의 두께를 확인합니다. 가벼운 압력을 가하면 두개골 표면이 약간 들어갑니다.

이미징을 위한 최적의 두개골 두께는 10에서 30 micron 사이입니다. 두개골을 얇게 만든 후, 윈도우의 모든 잔해물을 제거하고 두개골 위에 식염수를 도포하십시오. 해부 현미경에 장착된 디지털 카메라로 이미징 윈도우를 촬영하십시오.

이 사진의 뇌 혈관 구조는 이후의 이미징 세션에서 이미징 플레이트를 배치할 위치를 찾는 데 도움이 됩니다. 동물을 이광자 현미경 장치로 이동시키십시오. 동물은 가열 패드 위에 유지되어야 하며, 이미징 세션 전반에 걸쳐 체온을 지속적으로 모니터링해야 합니다.

Mi Tai 레이저가 장착된 이광자 현미경입니다. 최대 출력을 위해 10 watt 고체 펌프와 수정된 Olympus flow view 공초점 유닛이 사용됩니다. 이 시스템은 심부 조직 이미징에 최적화되어 있으며, 뇌에서 발생하는 형광을 최대한 검출할 수 있도록 외부 검출기를 대물렌즈에 최대한 가깝게 설치합니다. 낮은 디지털 줌을 사용하여 이미징 창에 식염수를 한 방울 추가하십시오.

현미경에 고정된 디지털 카메라를 사용하여 밝게 표지된 뉴런이 포함된 영역을 확인합니다. 그런 다음, 촬영 영역의 사진을 찍습니다. 이는 이후 시점에서 동일한 촬영 위치로 되돌아가기 위해 필요합니다.

수지상 돌기 분지의 범위를 보여주는 뇌의 가시적 전체 영역에 대해 저배율 스택을 획득하십시오. 혈관과 수지상 돌기가 어린 동물과 성체 동물 모두에서 구조를 유지하므로, 이는 이후 시점의 이미징 영역을 지정하는 데 사용될 것입니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 이를 수행하십시오.

디지털 배율을 8배로 높이고, 필요한 경우 XY 좌표를 조정한 후, 수지상 돌기의 가시(spine) 위치와 구조를 포함한 상세한 수지상 돌기 형태가 나타나는 고배율 스택을 수집하십시오. 팬 좌표, 수집 범위, Z-단계 크기 및 스택 내 단계 수를 포함하여 각 스택 수집에 관한 상세한 기록을 작성하십시오. 이 기록은 이후 시점에서 해당 수지상 돌기나 축삭으로 돌아올 때 사용됩니다.

이미징 후, 핀셋을 사용하여 헤드 플레이트를 두개골 표면에서 조심스럽게 분리하여 제거합니다. 잔여 접착제를 모두 제거하고 0.9% 멸균 식염수로 두개골을 닦아냅니다.

6번 봉합사로 두개골 위의 피부를 봉합합니다. 영상 촬영 절차가 끝나면 해당 부위를 70%ethanol로 닦아냅니다. 동물이 깨어나 움직일 수 있을 때까지 가열 램프가 있는 깨끗한 케이지에 둡니다.

그 후 동물을 원래의 케이지로 돌려보내고, 2일에서 수개월 후의 임의의 시점에 다시 촬영하기 위해 봉합사를 제거하고 머리 부분의 피부를 다시 엽니다. 무균법을 사용하여, 첫 번째 수술 중에 촬영한 뇌 혈관의 디지털 영상을 통해 원래의 촬영 위치를 찾습니다. 그런 다음 이전과 동일하게 헤드 플레이트를 다시 고정합니다.

필요한 경우, 미세 수술용 칼날을 사용하여 영상 촬영 시점 사이에 다시 자라났을 수 있는 뼈를 조심스럽게 깎아냅니다. 치과용 드릴로 얇게 깎아낸 후 영상 촬영 창의 잔해물을 제거하고 0.9% sterile saline 한 방울을 떨어뜨립니다. 동물을 이광자 현미경으로 옮기고, 이전 세션 중에 촬영한 디지털 형광 이미지를 사용하여 원래의 영상 촬영 영역을 찾습니다.

플로우 뷰 프로그램을 시작합니다. 원본 저배율 이미지를 열고, 컴퓨터 화면에 투명 필름을 부착한 뒤 투명 펜을 사용하여 주요 혈관 패턴을 스케치합니다. 그다음, 라이브 이미지를 열고 혈관 구조를 투명 필름에 스케치한 패턴에 맞춰 다시 정렬합니다.

8배 확대된 구조물을 다시 촬영하기 위해 투명 필름을 제거합니다. 이전 촬영 세션에서 수집된 스택 중 원하는 파일을 엽니다. 컴퓨터 화면에 부착된 투명 필름 위에 구조물을 스케치합니다.

실시간 이미지에서 8배 확대하고 이미지를 투명 필름과 정렬합니다. 저배율 위치 정렬의 정확도에 따라 이미지 각도를 약간 조정해야 할 수도 있습니다. 스텝 크기와 이미지 수를 포함하여 첫째 날의 이미징 파라미터로 팬 좌표를 설정하고 Z-stack 이미지를 수집합니다. 재이미징은 최대 두 번까지 수행할 수 있습니다. 두개골의 무결성을 저해하여 GFP를 발현하는 마우스에서 이미징 해상도가 낮아지는 것을 방지하기 위해 두피를 여는 횟수를 제한해야 합니다.

생체 내 이광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 5층의 파라메탈 세포(parametal cells) 일부와 그에 해당하는 수지상 돌기를 시각화하였으며, 여기에는 GFP로 표지된 시각 피질 수지상 돌기가 표시되어 있습니다. 이 이미지는 PIA부터 최종 깊이 175 µm까지 5 µm 간격으로 획득한 단일 이미지들의 투영 영상입니다. 상자 표시된 영역을 0일 차에 고배율로 보여주고, 다시 4일 차에 보여주며, 0일 차와 4일 차의 수지상 분지 이미지를 고배율로 비교하였습니다.

이 이미지들은 흰색 화살표 머리로 표시된 안정적인 가시, 빨간색 화살표 머리로 표시된 소실되어 수축 중인 가시, 그리고 녹색 화살표 머리로 표시된 새로운 가시를 보여줍니다. 지금까지 얇은 두개골 준비법을 사용하여 마우스 시각 피질에서 만성 2광자 이미징을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 두개골과 그 아래의 경막에 손상을 주지 않도록 두께를 얇게 만드는 과정에서 특별히 주의하는 것이 중요합니다. 손상이 발생하면 이미징 해상도가 낮아지므로 주의해야 하며, 상세한 기록을 남기시기 바랍니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.