만성 뇌 영상에 대한 Craniotomy 외과 절차

영상 기술은 뇌 기능 연구에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 그중에서도 이광자 레이저 현미경술은 적절한 준비 과정을 통해 살아있는 뇌를 연구할 수 있게 해주어 매우 유용한 방법으로 부상했습니다. 이 기술을 이용하면 동일한 피질 영역을 수 분에서 수개월까지 만성적으로 관찰할 수 있습니다.

이 영상에서는 이광자 현미경을 이용한 뇌의 만성 생체 내(in vivo) 이미징 준비 과정을 보여드립니다. 오늘 시연할 두개골 창(cranial window) 준비법은 Janelia Farm의 Howard Hughes Medical Institute 연구원인 Carl Voda 박사가 처음 개척하였습니다. 저는 University of California Los Angeles 신경과 Carlos Porter Cayo 연구실의 Ricardo Must입니다.

오늘은 만성 in vivo 이미징을 위한 두개창(cranial window) 제작 절차를 보여드리겠습니다. 이 준비 과정은 이광자 레이저 현미경을 사용하여 뇌 깊은 곳을 이미징할 수 있게 해주므로 매우 유용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

수술을 시작하기 전, 마우스는 이소플루레인(isoflurane)으로 마취합니다. 유도 시에는 4%, 수술 중에는 1.5~2%를 사용하며, I-A-C-U-C 승인 절차를 따릅니다. 동물이 완전히 진정되었는지 확인하기 위해 꼬리 또는 발가락 집기(pinch test)를 수행하는 것이 중요합니다. 설치류용 트리머를 사용하여 목 뒤부터 눈까지의 털을 깎아냅니다.

제모 후, 마우스를 37°C로 설정된 온수 순환 담요 위에 놓인 정위 고정기(stereotaxic frame)에 배치하고, 이어바(ear bars)를 사용하여 머리를 단단히 고정합니다. 그런 다음 동물의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안연고를 도포합니다. 이어서 dexamethasone 0.2 mg/kg과 carprofen 5 mg/kg을 피하 투여합니다.

뇌 부종 및 염증 반응을 각각 방지하기 위함입니다. 수술을 시작하기 전, 70% alcohol과 Betadine을 적신 면봉으로 피부를 세 번 교대로 닦아 수술 부위를 반드시 멸균하십시오. 모든 수술 도구는 에탄올을 분사한 가위와 함께 유리 구슬 멸균기를 사용하여 미리 멸균되었습니다.

머리 기저부를 따라 수평으로 절개한 후, 눈꺼풀에 거의 닿을 때까지 주둥이 방향으로 두 차례 절개하여 두개골 상단의 피부를 제거합니다. 그다음 중앙선에서 만나는 두 개의 사선 절개를 실시합니다. 이때 과도한 출혈이나 통증을 방지하기 위해 골막에 리도카인 및 에피네프린 용액 한 방울을 도포하고, 메스를 사용하여 골막을 두개골 가장자리까지 젖힙니다.

목 뒷부분의 근육층 또한 가볍게 견인합니다. 그런 다음 노출된 두개골 전 영역을 메스로 부드럽게 긁어 건조한 표면을 만듭니다. 이는 나중에 접착제를 도포할 때 접착력을 높이기 위해 매우 중요한 과정입니다.

이미징 부위가 결정되면, 먼저 두개골 창(cranial window)을 생성할 준비를 합니다. 공압식 치과용 드릴을 사용하여 지름 약 4mm의 원을 조심스럽게 그립니다. 가볍게 드릴링한 후, 리도카인 에피네프린 용액을 두개골 표면에 다시 도포합니다.

매우 얇은 뼈 층(보통 뼈 한 겹 정도)이 남았을 때 드릴링을 중단합니다. 이 단계는 생리식염수 한 방울을 떨어뜨린 후 두개골 절제술 부위의 중심을 부드럽게 눌러 뼈가 밀려 들어가는 느낌을 확인하고, 뼈의 해면 구조인 뼈trabecula를 활용함으로써 도달할 수 있습니다.

매우 얇은 팁 핀셋을 사용하여 두개골 절제 부위를 두개골로부터 들어 올립니다. 식염수는 두개골을 들어 올리는 것을 돕고 경막의 출혈을 방지하는 데 중요합니다. 다음으로, 두개골 제거 시 간혹 발생하는 미세 출혈을 멈추기 위해 미리 식염수에 적셔둔 겔 폼을 경막에 도포합니다.

경막 표면을 건조시키고 출혈이 없는지 확인한 후, 5mm의 멸균 유리 커버슬립을 경막 위에 조심스럽게 놓습니다. 시아노아크릴레이트 기반의 접착제 한 방울을 두개골의 반대쪽 뇌반구에 도포합니다. 바늘을 사용하여 유리 아래로 접착제가 들어가지 않도록 주의하며 윈도우 주변을 따라 접착제를 조심스럽게 도포합니다.

이제 두개골 전체 표면에 접착제를 얇게 도포할 수 있습니다. 접착제가 마르면 치과용 아크릴을 혼합하여 두개골 표면 전체에 도포하며, 이때 커버 슬립을 고정하기 위해 커버 슬립의 가장자리 일부까지 덮어줍니다. 커버 슬립을 고정한 후, 치과용 아크릴을 사용하여 윈도우 주변에 작은 웰을 만듭니다.

티타늄 바 또한 치과용 아크릴에 매립됩니다. 이 바는 나중에 마우스를 현미경 스테이지에 단단히 고정하는 데 사용됩니다. 이미징을 위해서는 바가 두개골 창과 평행하도록 수평을 맞추는 것이 중요합니다.

바 아래에 종이 한 장을 배치하면 아크릴이 굳는 동안 바의 수평을 유지할 수 있습니다. 치과용 아크릴을 10분 동안 경화 또는 경화시키면 티타늄 바가 제자리에 고정됩니다. 그런 다음 동물은 회복될 때까지 따뜻한 케이지에 넣습니다. 마취에서 회복된 후, 동물은 당일에 바로 영상 촬영이 가능합니다.

이 영상은 3개월 된 GFPM 마우스의 체성감각 피질 위에 설치된 두개창을 통해, 자체 제작한 이광자 현미경으로 5 µm 간격으로 촬영한 160장의 이미지 스택을 보여줍니다. 이 형질전환 마우스 라인은 피라미드 뉴런의 일부 하위 집합에서 GFP를 발현합니다. 5층 및 2-3층의 이미지는 910 nm의 여기 파장과 0.8 개구수(numerical aperture)를 가진 40x 수침 대물렌즈를 사용하여 촬영되었습니다.

더 표층의 이미지에서는 파라메탈 세포(parametal cells)의 정단 수지상 돌기(apical dendrites)의 수지상 분지를 쉽게 인식할 수 있습니다. 각 뉴런의 수지상 돌기 정단 묶음은 하나의 큰 정단 수지상 돌기로 수렴합니다. 이 주요 정단 수지상 돌기에서 뻗어 나오는 더 작은 사선 수지상 돌기(oblique dendrites)도 관찰할 수 있으며, 시야를 가로지르는 축삭(axons) 또한 뚜렷하게 보입니다.

이것은 동일한 40 x 대물렌즈를 사용하여 더 높은 배율에서 1.5 µm 간격으로 촬영한 12장의 이미지 스택입니다. 표면의 수지상 돌기가 개별 수지상 가시를 식별할 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도로 나타나 있습니다. 지금까지 투광자 현미경을 이용한 뇌의 만성적 이미징을 위한 두개창 준비 방법을 보여드렸습니다. 이 방법은 살아있는 뇌의 구조와 기능을 단일 이미징뿐만 아니라 수개월에 걸쳐 여러 차례의 만성적 이미징을 통해 연구할 수 있게 해주므로, 뇌 연구에 있어 매우 강력한 방법입니다.

두개창 준비의 또 다른 장점은 넓은 시야를 촬영할 수 있다는 점이며, 이를 통해 전체 뉴런이나 수 밀리미터 범위의 수상돌기 분지(dendritic arbor)와 같은 큰 구조물을 촬영할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 가능한 한 가장 깨끗하고 무균 상태인 환경에서 작업하고, 손을 매우 안정적으로 유지하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 끝났습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.