Pseudofracture : 급성 주변 조직 외상 모델

대퇴골이나 경골과 같은 장골이 골절되면, 손상된 근육과 연부 조직이 파손된 골편 및 골수에 노출됩니다. 이후 조직 수복을 돕기 위한 강력한 면역 반응이 뒤따릅니다. 이러한 노출의 영향을 연구하기 위한 모델은 양쪽 대퇴골과 경골을 채취함으로써 생성할 수 있습니다.

공여 마우스로부터 채취합니다. 뼈를 분쇄하여 골 용액을 만든 후, 이를 수혜 마우스의 손상된 허벅지에 주입합니다. 이후 면역 반응을 모니터링하고 원격 장기 손상을 평가하여 골절 유발 외상의 장기적 영향을 연구합니다.

양측 대퇴골 골절 모델과 같은 기존의 말초 조직 외상 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 가성 골절(pseudo fracture) 모델인 이 모델이 장시간의 마취나 복잡한 골절 고정 기술로 인한 합병증 없이 장기 생존을 가능하게 하여, 외상 후 후기 단계의 면역 반응 연구를 허용한다는 점입니다. 절차를 시작하기 전, 얼음 버킷, Betadine, 수술 기구, GRE 지혈鉗(hemostats), 막자와 절구, 포셉, 20 gauge 바늘, 1 CC 주사기, PBS, 마취제 및 isof fluorine 노즈콘을 준비하십시오. 연령과 체중이 일치하는 안락사된 개체 하나를 준비합니다.

유전자 공여 마우스는 수혜 마우스 3마리 분량의 충분한 재료를 제공해야 합니다. 공여 마우스를 플렉시글라스 보드에 고정하되, 뒷다리는 발끝 부분만 테이프로 고정하십시오. 뒷다리 부위를 조심스럽게 제모하십시오.

그 다음, 멸균을 위해 Betadine과 알코올로 완전히 도포한 후 하지의 긴 뼈를 제거하기 위해 서혜부 피부에 외과적 절개를 가하고, 발목까지 하지의 길이를 따라 피부를 계속 절개합니다. 내측과 외측 모두에서 피부를 견인하여 피하 근막 및 근육으로부터 박리합니다. 그다음 가위 날 하나를 경골의 전측 및 외측에 위치한 근육 아래로 삽입합니다. 날을 근위부와 원위부로 미끄러뜨려 근육을 하부의 뼈로부터 깨끗하게 들어 올립니다.

경골(tibia)의 후면 및 내측 하단에 이 기술을 반복하여 경골 아래의 근육들을 분리합니다. 원위 방향으로 밀어내어 이 다리 근육들의 근위단에서 비골(fibula)을 경골으로부터 떼어낼 때는 후면 쪽에 추가적인 힘을 최소한으로 가해야 합니다. 힘줄을 부착 부위와 최대한 가깝게 절단하고, 근육군을 함께 아래쪽으로 당기면서 근육을 원위 방향으로 견인합니다. 가볍게 당기면 발목 관절로부터 원위 부착부가 분리되며, 가위로 발목 관절을 절단합니다.

이 단계에서 경골을 대퇴골에서 분리하지 마십시오. 이 연결 부위는 대퇴골을 고관절에서 박리할 때 추가적인 지렛대 역할을 하여 해부를 돕습니다. 대퇴골에서 근육을 분리할 때도 이와 유사한 기술을 사용하십시오. 필요한 경우 후측과 내측 및 외측 모두에서 이 작업을 수행하십시오.

이 근육군들의 원위 부착부를 절단하여 무릎 관절로부터 분리합니다. 충분한 노출을 확보하기 위해 필요에 따라 피부 절개 부위를 확장하고 근육 아래쪽을 따라 진행합니다. 대퇴골 끝단을 고관절에서 분리하기 위해, 공여 마우스의 대퇴골과 경골 부착 부위를 제거하여 멸균 거즈 위에 놓습니다.

각 뼈를 한 손에 하나씩 잡고 긴 축을 따라 두 뼈를 서로 반대 방향으로 부드럽게 비틀거나 회전시켜 무릎 관절에서 두 뼈를 분리합니다. 긴 뼈에 남아 있는 힘줄 부착물을 제거하려면 4x4 크기의 거즈 조각으로 뼈의 길이를 감쌉니다. 거즈를 단단히 잡고 뼈 전체 길이를 따라 여러 번 긁어내어 표면에 남아 있는 조직을 제거합니다.

수집한 뼈를 얼음 위에 놓인 멸균된 1.5 milliliter 마이크로 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 공여 뼈를 철저히 소독된 생물안전작업대로 운반하십시오. 뼈 용액을 준비합니다.

후드 내에 멸균 필드 드레싱, 멸균 막자사발과 막자, 멸균 핀셋, 멸균 8 mL 튜브, 멸균 PBSA, 1 mL 피펫과 해당 피펫 팁을 준비해야 합니다. 해당 팁을 장착한 100 µL 피펫, 1 mL 주사기 및 20 gauge 바늘도 준비합니다. 핀셋을 사용하여 뼈를 막자사발로 옮긴 후, 막자를 이용해 뼈를 부드럽게 분쇄합니다. 막자사발에 1 mL의 PBS를 피펫으로 넣고, 원형 동작으로 남은 조각들을 계속 분쇄하여 완전히 부유시키십시오.

그런 다음 PBS 1 mL를 더 추가하고 계속해서 분쇄하여 분홍색을 띠는 골 용액을 만듭니다. 큰 잔여물은 남도록 주의하며 유발에 담긴 용액을 8 mL 튜브에 천천히 붓습니다. 이 골 용액을 1 mL 주사기로 옮깁니다.

20 gauge 바늘을 사용하여 뼈 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 뼈 용액 1 µL를 Mac congar 플레이트에 분주하고 표면에 고르게 펴 바릅니다. 멸균 상태를 확인하기 위해 플레이트를 24~48시간 동안 배양하십시오.

발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 펜토바르비탈(penta barbital)로 마취된 마우스의 마취 깊이를 평가하여 연조직 손상 및 골 용액 주입을 위한 수술 절차를 시작합니다. 마우스를 플렉시글라스 보드 위에 배와 위로 향하게(supine position) 배치하고, 40번 날의 오스카 클리퍼(Oscar clippers)를 사용하여 복부, 서혜부 및 허벅지 부위의 털을 깎습니다. 각 사지의 원위부를 접착면이 밖으로 향하게 한 얇은 테이프 조각으로 느슨하게 감아 동물을 고정합니다.

마우스를 멸균된 수술 구역으로 옮깁니다. 수술 부위를 Betadine으로 닦아냅니다. 그런 다음 알코올로 닦아 멸균합니다.

1 mL의 99% isof fluorine을 적신 거즈 조각이 들어 있는 노즈콘을 마우스에 씌웁니다. 동물의 호흡이 느려지기 시작하면 노즈콘을 제거합니다. 실험 과정 중 추가 마취가 필요한 경우, pentobarbital을 추가로 주입하거나 isof fluorine을 투여할 수 있습니다.

다음으로 멸균된 필드 드레싱을 접어 마우스의 하지와 머리 부분만 노출되도록 덮어줍니다. 본 연조직 손상 모델은 양측 후지 압착 손상입니다. 마우스의 후지가 약간 외전되고 외회전된 상태로 위치하도록 확인하십시오.

이는 정확한 근육에 접근하는 데 도움이 됩니다. 압착 손상을 유도하기 위해 슬관절 굴곡근을 그룹화합니다. 대퇴골의 중앙 지점에 있는 대퇴 후측 근육 주위에 18 centimeter 크기의 대형 지혈鉗(hemostat)을 고정하며, 이때 볼록한 곡면이 대퇴골을 향하게 합니다. 지혈鉗을 첫 번째 클릭 소리가 날 때까지만 잠그고 30 seconds 동안 유지합니다.

베벨의 끝부분이 대퇴골에 닿을 때까지 바늘을 피부를 통해 2~3mm 삽입합니다. 양측의 파쇄된 대퇴 근육 조직에 골 용액 0.15 milliliter를 주입합니다. 바늘을 빼낸 후, 멸균 장갑을 낀 손가락으로 주입 부위를 빠르게 눌러 상처 부위로 골 용액이 역류하는 것을 방지합니다.

이 손가락을 수 초 동안 그대로 유지하십시오. 생쥐를 다시 케이지에 넣고 마취가 풀리는 즉시 자유롭게 움직일 수 있도록 하십시오. 적절한 통증 관리는 생쥐가 깨어날 때 실시해야 합니다.

이 일반적인 도식은 0시간 시점의 외상 이후 발생하는 이상성 면역 반응을 보여줍니다. 외상이 유도됩니다. 이어서 초기 과염증 반응이 나타나며, 이는 6시간째에 정점에 도달하는 것을 확인할 수 있고 전신 염증 및 원격 장기 기능 장애 평가를 통해 측정됩니다.

외상 후 면역 반응의 두 번째 구성 요소는 면역 세포 기능 장애로 측정되는 지연성 면역 억제이며, 이는 약 48시간 전후의 저점으로 묘사됩니다. 이것은 외상 직후에 발생하는 혈장 내 염증성 사이토카인 반응의 대표적인 도식이며 전신 염증의 한 예입니다. 간 손상을 통해 측정된 원격 장기 기능 장애 또한 유사한 시간 범위 내에서 증가하는 것으로 나타났습니다.

이 대표 도식은 외상 후 후기에 나타나는 면역 세포 기능 장애를 강조하기 위한 예시입니다. 이 절차를 수행할 때, 실험 전 과정에서 멸균 상태를 유지하고 정밀하게 조작하는 것이 중요합니다. 이는 실제 골절이나 상처 감염 모델이 아닙니다.