그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정

이 실험 절차의 전반적인 목표는 이중층 가로지르는 단백질(bilayer spanning proteins)에 의해 감지되는, 약물로 유도된 이중층 특성 변화를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 형광 물질이 적재된 대형 단방향 소포(large unilateral vesicles)를 제작함으로써 달성됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 소포에 gramin을 도핑하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 외부 소광제(quencher)를 첨가하고 내부 형광체의 소광 속도를 측정하는 것입니다. 넷째, 절차의 마지막 단계는 형광 시간 경과 곡선에 신축 지수 함수(stretched exponential function)를 피팅하여 gramin 활성에 따른 형광 소광의 변화를 정량화하는 것입니다. 최종적으로, amfi 파일이 지질 이중층 특성을 변화시킬 수 있는지 평가하기 위한 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 Ola Anderson입니다. 안녕하세요, 저는 Helson입니다. 안녕하세요, 저는 Richie Kapo입니다.

저는 Weill Cornell Medical College 생리학 및 생물물리학과의 Olaf Anderson 박사 연구실 소속 Leah Sanford입니다. 오늘은 지질 이중층 특성의 변화를 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 약물과 저분자 화합물이 지질 이중층 특성에 미치는 영향을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작해 보겠습니다. 이 절차의 첫째 날에는 냉동고에서 지질을 꺼내 실온에서 평형을 맞춥니다. 평형이 맞춰지면, 25 mL 라운드 바텀 플라스크에 25 mg/mL 농도의 지질 및 클로로포름 용액 0.6 mL를 넣습니다. 그런 다음 모든 클로로포름이 증발할 때까지 플라스크를 계속 회전시키면서 질소 가스 하에서 용액을 건조시킵니다.

지질의 얇은 흰색 막이 플라스크의 하단 전체를 덮고 있으며, 진공 데시케이터에서 하룻밤 동안 지질을 추가로 건조합니다. 100 mM sodium nitrate, 25 mM ANTS 및 pH 7의 10 mM HEPES 용액을 준비합니다. 이 용액의 pH를 조절할 때 염화물을 함유한 용액은 사용하지 마십시오.

탈륨 퀀처(thallium Quencher)가 이틀째 되는 날 염화물과 불용성 복합체를 형성하므로, 1.67 mL의 전해질 용액으로 지질을 재수화하여 10 mM 지질 현탁액을 만듭니다. 적정 농도에 도달하면 파라필름으로 덮고 현탁액을 충분히 볼텍싱한 후, 알루미늄 호일로 시료를 빛으로부터 보호하여 상온에서 하룻밤 동안 숙성시킵니다.

3일 차에, 저출력 초음파 처리기로 혼합물을 1분 동안 초음파 처리합니다. 그 다음, 드라이아이스에서 5분, 온수에서 5분 순으로 샘플을 동결-융해시키며, 이 동결-융해 사이클을 4~5회 반복합니다. Avanti mini extruder를 사용하여 지질 현탁액을 압출합니다.

0.1 micron 폴리카보네이트 필터와 필터 지지대를 장착하여 미니 압출기를 설정하고, 반투명한 현탁액이 반대편 시린지에 담길 때까지 현탁액을 21회 왕복 압출하여 대형 단일층 소포(LUV) 현탁액을 제조합니다. 나트륨 완충액으로 평형화된 PD 10 탈염 컬럼에 압출된 현탁액을 통과시켜 외부의 ANTS를 제거합니다. LUV 현탁액 1.5 mL와 나트륨 완충액 1 mL를 컬럼에 추가합니다.

용액이 컬럼에 완전히 흡수되면, 3 mL의 소듐 버퍼로 리포좀을 용출시키고 용출액을 수집합니다. 생성된 A NTS 충전 LUV 스톡 용액은 약 4~5 mM의 지질을 함유해야 하며, 반투명한 우윳빛 흰색으로 보여야 합니다.

용액을 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단하고 13 °C에서 보관하며, 사용 24시간 전에 충분히 볼텍싱하십시오. A NTS로 충전된 LUV 스톡 용액. UUV는 밀도가 1 g/mL보다 크므로 침전될 수 있습니다.

그 다음, A NTS가 충전된 LUV 스톡 용액을 소듐 버퍼로 1:20으로 희석합니다. 리포좀의 4분의 3 양을 DMSO에 녹인 260 nanogram의 abidin과 함께 배양합니다. 나머지 4분의 1 양에는 gramin이 포함되지 않은 동일한 부피의 DMSO를 첨가합니다.

모든 샘플의 용매 농도를 일정하게 유지하기 위해, 13 °C에서 24시간 동안 그라민(gramin)이 지질 소포의 내측 및 외측 단분자층 사이에서 평형을 이루도록 합니다. 여기서는 온도 제어 기능이 있는 Applied Photophysics SX point 20 stopped flow 분광 형광 광도계를 사용하여 형광 소광 속도를 측정합니다. 시작하기 전, 기기 예열을 위해 한 시간 전에 전원을 켭니다.

들뜸을 위한 슬릿 너비는 1/1로 설정해야 하며, pro data SX 소프트웨어를 사용하여 방출을 기록할 때는 455 nm 하이패스 필터를 사용해야 합니다. 기록 조건을 먼저 설정하고, 단색화 장치의 들뜸 파장을 352 nm로 설정하십시오. 압력 유지 설정을 사용하십시오.

시간을 1초로, 포인트 수를 5,000으로 설정하십시오. 반복 횟수는 버퍼 런의 경우 9회로, 퀀처 런의 경우 13회로 조정하십시오. Essex 소프트웨어의 check drive 프로파일에서 온도를 모니터링하십시오.

구동 부피는 각 시린지에서 60 µL씩 혼합되는 120 µL로 설정해야 합니다. 이렇게 하면 데드 타임(dead time)은 약 1.2 ms가 됩니다. 형광 검출기의 고전압 또는 게인을 약 420 V로 조정하십시오.

목표는 약 8의 형광 읽기 값을 얻는 것입니다. 이전에 준비한 NTS가 로딩된 UUV를 암조건의 25 °C에서 10분 동안 평형화합니다. 평형화가 완료되면 샘플을 볼텍싱한 후 왼쪽 시린지에 로딩합니다. 오른쪽 시린지에는 나트륨 완충액 또는 thallium Quencher를 로딩합니다.

시린지를 앞뒤로 밀어 기포를 모두 제거합니다. 두 시린지에는 동일한 양이 충전되어야 합니다. 첫 번째 샘플을 위해 밸브를 닫기 전, 소듐 버퍼로 형광을 기록하십시오.

네 번 반복하고 필요에 따라 게인을 조정하십시오. 그런 다음 나머지 샘플에 대해 다섯 번 더 반복하십시오. 나트륨 완충액으로 9회 반복 측정하여 기록하십시오.

나트륨 완충액을 탈륨 퀀처(thallium quencher)로 교체하고 13회 반복 측정합니다. 물로 헹구고 다음 샘플 대조군 측정을 계속합니다. 그라민(gramin)과 용매가 없는 샘플, 그리고 그라민은 없으나 화합물 농도가 최대인 샘플을 포함하십시오.

형광 분석 후 gramin과 용매 모두에 대해 데이터를 MATLAB 소프트웨어로 읽어 분석합니다. 읽어 들인 각 샘플의 모든 완충액 및 소광제 반복 측정값 중에서, 처음 4회의 반복 측정값은 튜브 내에 이전에 남아 있던 물질에 의해 오염될 수 있습니다. 이 경우, 신호는 나트륨 완충액 샘플이 이전 세척 단계의 물과 혼합되면서 발생합니다.

5회부터 9회까지의 반복 측정값은 샘플 단독의 신호를 나타냅니다. 따라서 각 경우에서 처음 4회의 반복 측정값은 항상 제외합니다. 혼합으로 인한 인위적 오류를 방지하기 위해, 트레이스를 수동으로 검토하여 혼합 오류나 기포로 인해 스파이크 또는 편차가 발생한 빨간색 트레이스와 같이 상태가 좋지 않은 반복 측정값을 제거하십시오.

그 다음, 각 실험 조건의 각 샘플에 대해 퀀처 반복 측정값을 버퍼 반복 측정값의 평균 시작 값으로 정규화하고, 모든 샘플의 평균을 하나의 그래프로 통합합니다. 그라민(gramine)이 없는 시각화 샘플들은 모두 유사해야 하며 형광 소광이 거의 나타나지 않아야 합니다. 그람시딘(gramicidin)이 포함된 샘플의 경우, 탈륨 이온이 소포 내부로 천천히 유입됨에 따라 형광 신호가 서서히 감소합니다. 화합물에 의해 형광 시간 경과 곡선이 눈에 띄게 변화했다면, 해당 화합물이 테스트 농도에서 지질 이중층의 특성을 변화시킨 것입니다. 다음으로, 정규화된 형광 소광 곡선의 초기 2~100ms 구간에 스트레치 지수 함수(stretched exponential)를 피팅합니다.

개별 반복 실험에 대해 2밀리초에서의 속도를 계산하십시오. 그런 다음 개별 반복 실험 값을 바탕으로 주어진 시료의 평균과 표준 편차를 계산하십시오. 여기서 cap으로 표시된 캡사이신의 효과를 ga로 표시된 그라민의 부재 또는 존재 하에서의 형광 소광 시간 경과에 따라 관찰하였습니다. 정규화된 형광 신호가 여기의 1초 동안 나타나 있습니다. 회색 점은 모든 반복 실험의 결과를 나타내며, 빨간색 선은 평균값을 나타냅니다.

정규화된 형광 신호의 처음 100 밀리초가 표시되어 있습니다. 회색 점은 각 조건에 대한 단일 반복 결과입니다. 빨간색 선은 해당 반복 횟수에 대한 신축 지수 피팅(stretched exponential fits) 결과입니다.

점선으로 표시된 파란색 선은 2ms 지점을 나타내며, 이 시점에서 소광 속도를 측정합니다. 소광 속도의 상대적 변화는 gramin만 포함하고 수정제가 없는 대조군 샘플을 기준으로 데이터를 정규화하여 결정합니다.

캡사이신이 지질 이중층에 흡수되면 이중층의 특성이 변화합니다. 이중층이 더 유연하게 변함에 따라, 모노머-다이머 평형(mono dimer equilibrium)의 그램 측(gram side)이 전도성 다이머 쪽으로 치우치는 변화가 나타납니다. 지금까지 소분자가 지질 이중층을 교란하는 효과를 측정하는 절차를 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때는 동일한 배치의 소포를 사용하여 각 실험에 적절한 대조군을 사용하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모두 마쳤습니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.