GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

본 절차의 전반적인 목표는 grk 채널을 조절하는 새로운 약물을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 A TT 20 세포를 96 웰 플레이트에 도말함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 Verset 액체 플레이트 핸들링 시스템을 사용하여 테스트 화합물을 희석하는 것입니다.

다음으로, 희석된 테스트 화합물을 verset을 사용하여 세포에 처리합니다. 마지막 단계로 96-well plate를 Synergy two 형광 플레이트 리더기에 삽입하고, 대조군 및 소마토스타틴 용액을 well에 주입합니다. 최종적으로, 형광 플레이트 리더기를 사용하여 소마토스타틴으로 유도된 형광 신호를 변화시켜 Grk 채널을 조절하는 화합물을 확인합니다.

이 절차의 패치 클램프 기록(patch clamp recording)과 같은 기존 방법 대비 장점은, 다수의 화합물을 빠르게 스크리닝하여 이들이 gerk 채널을 조절하는지 여부를 결정할 수 있다는 점입니다. Gerk 채널을 활성화하여 FI 통각 수용성 전달의 억제를 유도하는 화합물을 식별할 수 있기 때문에, 이 기술의 영향은 통증 치료까지 확장될 수 있습니다. 96웰 플레이트 코팅 및 세포 플레이팅 절차를 시연하는 사람은 Maribel Vasquez입니다.

실험실의 학생은 먼저 5% CO2가 포함된 습윤 환경의 37°C에서 10% horse serum이 첨가된 DMEM으로 pituitary ATT 20 세포를 배양하여 이 절차를 시작합니다. 표준화된 절차에 따라 5~7일마다 세포를 계대 배양하여 배양 상태를 유지합니다. 다음으로 black clear의 웰을 코팅합니다.

96-웰 플레이트 바닥에 50 µL의 poly L lysine을 분주합니다. 인큐베이터 내에서 30분 동안 웰을 건조시킵니다. 그 후 과량의 poly L lysine을 제거하고, 200 µL의 배지가 포함된 96-웰 플레이트에 웰당 30,000 cells의 밀도로 세포를 접종합니다.

그 후 세포를 인큐베이터에 3~4일 동안 보관합니다. 흡입 장치를 사용하여 세포 단일층에서 배양액을 천천히 흡입한 다음, 200 µL의 일반 완충액으로 세포를 세척합니다. 이어서, 막 전위 민감성 염료가 포함된 완충액 200 µL를 각각 첨가합니다.

세포를 37°C에서 40분 동안 배양합니다. 40분 후, 인큐베이터에서 ATT 20 세포를 꺼내 실온으로 되돌린 다음, 기존의 버퍼를 흡입하여 제거합니다. 그 후 MPD가 포함된 신선한 버퍼 용액을 세포에 처리합니다.

다음으로, 액체 핸들링 시스템을 사용하여 시험 화합물과 대조 용액을 다양한 농도로 세포에 처리합니다. 96-웰 플레이트에서 형광 측정 전까지 세포를 시험 화합물과 함께 5분 동안 배양합니다. 이 과정에서 96-웰 플레이트를 biotech synergy two 형광 플레이트 리더기에 삽입합니다.

방출 파장 520 nanometers 및 emission 파장 560 nanometers에서 형광 배경 신호를 측정합니다. 그 후, Synergy two 인젝터 시스템을 사용하여 G PCR R 리간드 또는 대조군 용액을 웰에 첨가하여 GIR 채널을 활성화합니다. 이어서 302초의 샘플링 기간 동안 10초 간격으로 데이터 포인트를 수집합니다.

들뜸 및 방출 파장에서 측정합니다. 분석법의 신뢰도를 결정하기 위해 Z-인자를 계산합니다. 0.5에서 1.0 범위의 Z-인자는 분석법의 품질이 매우 우수함을 나타냅니다.

Z factor가 0.5 미만인 플레이트는 제외되었습니다. 형광 신호를 조절하는 화합물에 대한 분석 결과, inward rectifier potassium channel 특이성을 확인하기 위해 2 mM barium chloride 또는 500 nM terapin Q 존재 하에 재시험을 수행하였습니다. 여기에 제시된 것은 somatostatin 또는 대조 용액을 첨가한 ATT20 세포에서 시간에 따라 측정된 대표적인 HLB 0 2 1 1 15 2 형광 신호입니다. Y축의 형광 강도 비율은 somatostatin 또는 대조 용액 존재 하의 신호를 somatostatin 또는 대조 용액 첨가 전의 기저 신호(baseline signal)로 나누어 계산하였습니다.

여기서는 ATT 20 세포를 500 nM Terapin Q로 처리한 결과가 나타나 있습니다. Terapin Q는 두 개의 G 채널에 결합하여 이를 차단함으로써 소마토스타틴에 의한 형광 신호 감소를 억제합니다. 또한, 20 µM propafenone으로 ATT 20 세포를 처리한 결과가 나타나 있으며, 이 또한 소마토스타틴에 의한 형광 신호 감소를 억제합니다. 이 기술에 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 형광 플레이트 리더를 사용하여 grk 채널을 조절하는 약물을 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.