칙 태아의 단일 세포 Transfection

본 절차의 전반적인 목표는 닭 배아의 체절 또는 신경관의 단일 세포에 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 주입하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 팁 개구 직경을 가진 미세주입 피펫을 제작함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 주입을 위한 플라스미드 스탁을 준비하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 주입을 위해 배아를 준비하는 것입니다. 네 번째 단계는 마이크로 피펫에 플라스미드 DNA를 채우는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 원하는 조직에 주입하는 것입니다.

최종적으로, 면역형광 현미경 관찰을 통해 선택된 체절 및 신경관 하위 영역의 단일 표지 전구세포로부터 생성된 세포 수의 파생 범위에 관한 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 예루살렘 히브리 대학교 의학 신경생물학과의 Heim 교수님 연구실 소속 Rael입니다. 오늘은 닭의 체절과 신경관에 단일 세포를 주입하는 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 소마이트(somite) 및 신경관 세포의 계보 분리를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 병아리 배아에서 단일 형질전환 세포를 생성하려면 마이크로 피펫 제작부터 시작하십시오. 표준 Naga PP 83 피펫 풀러(pipette puller)를 사용하여 열 설정을 13.5로 맞춘 후 피펫을 제작합니다.

피펫 팁 직경을 8에서 10 µm 사이로 맞추기 위해 정밀한 설정 보정이 필요합니다. 본 실험에서는 외경 1 mm, 내경 0.75~0.78 mm의 붕규산 유리관이 포함된 필라멘트를 사용합니다. 외경 1 mm, 내경 0.75 mm의 필라멘트가 없는 시판 마이크로 피펫을 사용할 수도 있습니다.

준비된 피펫은 팁이 용기 가장자리에 닿지 않도록 보호한 상태로 플라스틱 접시에 보관합니다. 미세주입용 DNA를 준비하기 위해, 목적 플라스미드를 DH5α E. coli에 형질전환합니다. 다음 날 표준 절차에 따라 Maxi prep 키트를 사용하여 플라스미드를 정제하며, 비클론성 주입의 경우 DNA 농도를 1 µg/µL로 사용합니다.

개별 클론을 얻고자 하는 실험의 경우, 플라스미드 농도를 훨씬 낮게 설정하여 조정해야 합니다. P-C-A-G-G-F-P-A의 경우 0.05 to 0.1 µg/µL 농도가 적절합니다. 최적 농도가 결정되면, 매번 개별적으로 조제하기보다 정제된 플라스미드 스톡 전체를 미리 정해진 농도로 희석하여 사용하는 것을 권장합니다.

후자는 순도 및 슈퍼코일 플라스미드의 비율과 같은 기타 파라미터의 차이로 인해 성공률에 어느 정도 변동을 일으킬 수 있습니다. 미세주입을 위해 준비할 닭의 알을 원하는 발달 단계까지 장축 방향으로 뉘어 배양한 후, 70% ethanol로 닦아내고 건조시킵니다. 다음으로, 수술용 가위로 알의 뾰족한 끝부분을 뚫습니다. 10 milliliter 주사기와 19 gauge 바늘을 사용하여 알에서 2 milliliters의 알부민을 뽑아내고, 주입 전에 구멍을 뜨거운 파라핀으로 밀봉합니다.

수술용 가위를 사용하여 알껍데기 상단에 창을 만들어 이물질이 구멍으로 들어가는 것을 방지합니다. 창 위에 테이프 조각을 붙이고 그 위에 구멍을 뚫습니다. 배아를 시각화하기 위해, 흡입기에 장착된 화염 인발 모세관을 사용하여 blasted derm 아래에 pelican 17과 같은 무독성 잉크를 주입합니다.

다음으로, 니들 홀더에 장착한 0.14 millimeter 곤충 핀을 사용하여 배아를 감싸고 있는 외배엽 또는 양막을 절개하고 젖혀 배아에 접근한 후, 풀드 피펫(pulled pipette) Eloqua에 DNA를 로딩하고 모세관을 사용하여 소량의 fast green 파우더를 첨가합니다. 적절한 직경의 모세관에 소량의 플라스미드를 올린 후 아스피레이터(aspirator)로 흡입합니다. 그런 다음, 뾰족한 팁의 반대편 피펫 끝에 모세관을 삽입하고 DNA를 뾰족한 끝부분에 최대한 가깝게 로딩합니다.

다음으로, 마이크로 조작기에 장착된 수동 공기압 주입기에 피펫을 연결하십시오. 필요한 경우 최소한의 압력을 가하여 플라스미드 용액이 피펫 팁 끝까지 도달하게 합니다. 피펫 팁의 막힘을 방지하기 위해 적절한 공기압을 가하면서 피펫을 알의 액체 배지 내부로 조작하여 이동시키십시오.

해당 조직 영역을 관통하면 압력 변화만으로도 가시적인 fast green이 포함된 플라스미드가 방출되는 경우가 많습니다. 방출되지 않을 경우, 플라스미드와 fast green 혼합물이 배출될 때까지 주사기에 약간의 압력을 가하십시오. 이 절차를 배아의 축을 따라 반복하며, 주입 후에는 PBS를 추가할 수 있습니다.

마지막으로, 점착 테이프로 창을 밀봉하고 배아를 인큐베이터로 옮깁니다. 환기를 피하고, 습도를 유지하여 수율을 높이기 위해 인큐베이터 안에 작은 물 그릇을 함께 둡니다. 주입 대상 부위가 등쪽 체절의 신경관이나 외배엽 내와 같이 충분히 표면적이어서 쉽게 확인할 수 있는 경우, 형광 이안 현미경을 이용한 전체 마운트 관찰을 통해 실험 성공률을 측정할 수 있습니다.

이 단계는 너무 많은 또는 너무 적은 수의 세포가 표지되었는지를 평가하는 데 특히 유용합니다. 추가 배양이 필요한 경우, 관찰 후 PBS 용액이 포함된 항생제를 난자에 첨가하고 실링 테이프를 교체하십시오. 또한, 배아를 연속 절편화하여 면역조직화학 염색을 수행함으로써 주입 성공률을 평가할 수 있습니다.

주입 후 4시간 이상이 지나면 배아를 고정하고 파라핀 절편 제작 과정을 진행합니다. 유리 슬라이드에 부착된 절편의 탈파라핀화를 거친 후 면역염색을 통해 리포터를 시각화하며, 비오틴-스트렙타비딘과 같은 증폭 방법을 사용하는 것이 바람직할 수 있습니다. 마지막으로, 연속 절편을 스캔하여 주입된 분절 내의 표지된 세포를 검출합니다.

초기 실험 시 단일 세포가 아닌 다수의 세포가 얻어진다면, 플라스미드 스톡을 희석하여 적절한 결과가 얻어질 때까지 과정을 반복해야 합니다. 당사는 일반적으로 배아당 6~12개의 분절을 대상으로 하며, 각 소마이트(somite)당 P-C-A-G-G-F-P를 1회 주입합니다. 이 설정 하에서, 주입 8시간 후 전체 마운트 관찰(whole mount observation)을 통해 10개의 배아 중 적어도 하나의 배아 내 최소 한 개 분절에서 명확한 신호를 검출할 수 있습니다.

본 예시에서는 소마이트(somite)에 GFP 인코딩 플라스미드를 주입하였으며, 5시간 후 여기에 제시된 배아의 전체 마운트 뷰에서 단일 형광 세포가 관찰됩니다. 중앙 소마이트에 주입한 후 24시간이 지나 관찰하면, 클론 주입 2일 후 전체 마운트 배아에서 형광 세포 클론이 관찰됩니다. 해당 분절을 절편화하면 진피와 근육 모두에서 클론 후손이 나타나며, 이는 단일 전구세포가 두 가지 파생물을 모두 생성한다는 것을 입증합니다.

체절과 마찬가지로, 여기 주입 5시간 후에 촬영한 횡단면 사진에서 보는 바와 같이 등쪽 신경관의 단일 신경 상피 전구세포 또한 관통될 수 있습니다. 연속 절편 분석 결과, 성공률이 약 10%일 때 클론성 형질전환이 달성된 것으로 나타났습니다. 이는 클론성을 확보하기 위해 이 기술이 정의상 매우 비효율적임을 의미합니다. 반면, 이러한 조건 하에서 양성 표지 이벤트의 93% 이상이 클론성인 것으로 밝혀졌습니다.

지금까지 이 절차를 수행할 때 닭 배아의 단일 세포에 주입하는 방법을 보여드렸습니다. 대량의 스톡 플라스미드를 단일 세포 감염에 적합한 이상적인 농도로 희석하고, 이를 모든 실험 과정에서 사용하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.