DNA 조각을 Electroeluting

안녕하세요. 오늘은 제한효소 처리 및 PCR 산물과 같은 DNA 단편을 정제하기 위한 전기용출(electrolution) 방법을 보여드리겠습니다. 클로닝이나 시퀀싱과 같은 추가 목적을 위해 전기용출은 유용한 선택 방법 중 하나가 될 수 있습니다. DNA의 음전하 특성을 이용하여, 전기장 내에 높은 세포 장벽을 배치함으로써 단편들을 떨어뜨리고 더 이상의 이동을 방지합니다.

이 방법은 다양한 소스로부터 광범위한 크기의 DNA 단편을 최대 80%의 비교적 높은 효율로 정제할 수 있게 해줍니다. 저렴한 비용은 컬럼이나 레진 키트와 같은 다른 정제 방법과 비교했을 때 전기 용출(electrolution)이 갖는 또 다른 장점입니다. 먼저, 정제하고자 하는 표적 단편을 시각화하고 식별하기 위해 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색된 아가로스 겔 전기영동으로 DNA 샘플을 확인해야 하며, 이후 전기영동을 진행해야 합니다.

단편들이 잘 분리되어 있으면, 크기가 작은 단편들을 정밀하게 결정할 수 있습니다. 전기영동 후, 새 면도날을 사용하여 겔에서 원하는 단편을 깔끔하게 절제하며, 이때 겔 조각을 관심 밴드에 최대한 가깝게 맞추어 절단하도록 주의합니다.

본 절차는 UV 광선으로부터 적절히 보호된 상태에서 장갑을 착용하고 수행해야 합니다. 전해 용출기(electroluter)에 적절한 용출 버퍼를 채우고 중앙 플랫폼 표면에 버퍼가 충분히 덮이도록 주의한 후, 겔 슬라이스를 V-채널에 최대한 가깝게 휠 내부의 한 곳에 배치합니다. V-채널 내부에 기포가 없어야 합니다.

채널을 버퍼로 세척하여 갇혀 있는 공기를 제거함으로써 이를 방지할 수 있습니다. 그 다음, 웰에 가까운 쪽에서 V 채널로 100 µL의 고농도 염 배리어를 조심스럽게 첨가합니다. 챔버를 밀폐하고 전극을 전원에 연결하여 100 ~ 120 V에서 전기 용출을 시작합니다.

타임랩스는 프래그먼트 크기에 따라 달라지며, 최대 20 kb의 큰 프래그먼트의 경우 50분에서 1시간이면 충분합니다. 작은 프래그먼트는 염 용액을 통해 말단 성인 버퍼 체인으로 추가 용출되는 것을 방지하기 위해 UV 광선으로 10분마다 모니터링해야 합니다. 본 실험에서는 ND one 및 entry 효소로 560 ng의 플라스미드를 소화시켜 900 bp 프래그먼트를 분리했으며, 이는 샘플 84 ng에 해당합니다.

이에 따라, 겔 슬라이스를 웰 안에 넣은 후 100 volts에서 25분 동안 전기 용출(electro elution)을 진행합니다. 전기 용출이 완료되고 DNA 단편들이 V 채널 내의 하단 쿠션에 포집되면, 리셉터클의 원위단 쪽 채널에서 400 µL의 용액을 회수합니다. 마이크로 피펫에 장착된 파인 팁을 사용하여 이를 1.5 µL 마이크로 튜브에 옮긴 후, 2배 부피의 차가운 절대 에탄올을 첨가하고 볼텍스로 혼합하여 알코올 침전을 진행합니다. 또한, DNA 회수율을 높이기 위해 2~3 µL의 글리코겐을 추가할 수 있습니다. 튜브를 -20 °C에서 1시간 동안 또는 하룻밤 동안 보관한 후, 4 °C에서 최대 속도로 25분 동안 원심 분리합니다.

이 상층액과 세척액에 차가운 70% ethanol 1 mL를 첨가합니다. 4 °C에서 최대 속도로 5~10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 튜브를 뒤집은 상태로 실온에서 건조합니다. 10~15 µL의 nuclease-free water에 다시 현탁하여 시료의 농도를 측정합니다. 본 실험에서는 정제된 시료를 10 µL의 물에 재현탁하고 분광광도계의 260 nm 파장에서 정량하였으며, 그 결과 6.3 ng/µL의 농도로 75%의 효율을 나타냈습니다. 소중한 시간을 단 10분만 투자하여 키트를 사용하는 것이 더 효율적이라고 생각하실 수도 있습니다.

하지만 이 과정에 많은 시간이 소요됨에도 불구하고, 다양한 크기와 기원을 가진 더 넓은 범위의 시료를 정제할 수 있도록 여러 변수를 제어할 수 있게 됩니다. 이번 사례에서 보셨듯이, 대부분의 DNA 정제 키트와 비슷하거나 더 우수한 75%의 효율이 관찰되었습니다. 오늘 함께해 주셔서 감사합니다.

이 프로토콜이 귀하의 연구 프로젝트에 유용하게 활용되기를 바랍니다.