형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

다음 실험의 전반적인 목표는 새로운 flu genic, DNA, Zyme 프로브를 사용하여 e coli와 같은 특정 박테리아의 존재를 신속하게 검출하는 것입니다. 먼저, ligation을 통해 genic DNA. Zyme 프로브를 생성합니다. 그 다음, 표적 분자의 수를 농축하기 위해 박테리아를 배양하고, 상층액으로부터 세포 외 혼합물을 준비합니다.

그 다음, 조 추출된 세포 외 혼합물을 DNA zyme 프로브와 결합시킵니다. DNA zyme 프로브와 표적 분자 사이의 상호작용은 프로브의 절단을 유도하며, 이로 인해 형광이 발생합니다. 형광계를 사용하여 프로브와 표적 사이의 상호작용을 상대적 형광 강도의 증가로 확인합니다. 이후 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 분석을 통해 결과를 검증합니다.

이 기술이 PCR이나 항체 기반 방법보다 갖는 주요 장점은 절차가 더 단순하고 수행하기 쉽다는 점입니다. 이 방법은 모델 박테리아인 e coli를 통해 개발되었으나, 다른 모든 식중독균이나 병원 내 감염 박테리아 병원균의 검출에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 생소한 연구자들은 합성 DNA 프로브와 박테리아 취급에 익숙하지 않아 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 프로토콜의 절차 시연은 저희 실험실의 연구 보조원인 Sergio Aguire와 박사후 연구원인 Monso Ali가 진행합니다.

R-F-D-E-C 1은 특징적인 DNA Zyme입니다. 이는 검은색으로 밑줄 쳐진 촉매 서열 EC 1과 초록색으로 밑줄 쳐진 기질 서열 FS 1로 구성됩니다. 기질 내에는 파란색 r로 표시된 RNA 연결 부위가 있으며, 이는 F로 표시된 형광 표지 DT와 Q로 표시된 퀀처(quencher) 표지 DT 사이에 위치합니다. RF SS 1은 RFD EEC 1의 스크램블 버전으로, 촉매 서열 EEC 1은 SS 1 내에서 부분적으로 섞여 있으나 FS 1 부분은 변경되지 않은 상태입니다. RF DEC 1과 RF SS 1은 R-F-D-E-C 1의 표적으로 사용될 조섬유 세포외 혼합물(cem)을 준비하기 위해, 결합 템플릿인 LT 1의 존재 하에 올리고뉴클레오타이드 FS 1을 올리고뉴클레오타이드 EC 1 또는 SS 1과 템플릿 매개 효소 결합을 통해 제작합니다. 먼저 피펫 건을 사용하여 멸균된 14 mL 배양 튜브에 2 mL의 LB를 분주하는 것으로 시작하십시오.

다음으로, 멸균된 피펫 팁을 사용하여 agar 플레이트에서 e coli 단일 콜로니를 채취하여 LB가 들어있는 배양 튜브에 넣습니다. 튜브를 37 °C로 설정된 배양기에 넣고 14시간 동안 배양한 후 250 RPM으로 흔들어 줍니다. 1% 재접종 배양액을 만들기 위해, 14 mL 배양 튜브에 신선한 LB 2 mL를 분주하고 이전 단계에서 준비한 박테리아 배양액 20 µL를 추가합니다.

각 박테리아 용액의 OD 600 값이 약 1이 될 때까지 37 °C에서 250 RPM으로 진탕 배양합니다. 각 배양액 1 mL를 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 11,000 G에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 원심분리 후 투명한 상층액을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

상층액을 -20°C에서 보관하십시오. DNA 효소와 조세포 추출물(crude cell extract)의 상호작용으로 형광 신호가 생성되는지 확인하기 위해 즉시 사용하지 않는 경우, 샘플을 분광 광도법으로 분석합니다. 형광 분광 광도계를 켜고 여기 파장 488 nm, 방출 파장 520 nm로 데이터 수집 파라미터를 설정하십시오.

또한 기기가 1시간 동안 매분 측정값을 기록하도록 설정하십시오. 3개의 석영 크리스탈 큐벳을 먼저 증류 탈이온수로 세척한 다음 100% ethanol로 세척하십시오. 질소 가스를 분사하여 큐벳을 건조시키십시오.

큐벳에 대조군 1은 C1, 대조군 2는 C2, 시험군은 T로 표시합니다. 다음으로 C1에 24 µL의 증류 탈이온수를 넣고, C2와 T에는 준비된 E. coli 조제 세포 외 혼합물 24 µL를 각각 옮깁니다. 각 큐벳에 2X RB 25 µL를 추가하고 형광 분광광도계에 넣습니다. 5분 후에 형광 데이터 수집을 시작하고, 형광 측정값이 중단되지 않도록 주의하며 C2에는 5 µM RFS S1 1 µL를, T와 C1에는 5 µM RFD eec1 1 µL를 각각 추가합니다. 피펫팅으로 각 용액을 혼합한 후, 데이터 수집 기간이 끝날 때까지 반응을 유지합니다.

데이터를 Excel 파일 형식으로 저장하십시오. 그런 다음 데이터를 개인용 컴퓨터로 전송하고 Excel을 사용하여 그래픽 이미지를 생성하십시오. Spectra 분석에 사용된 것과 동일한 반응 혼합물을 사용합니다.

광도 측정법은 겔 전기영동 분석에 활용될 수 있습니다. 1시간 동안의 획득 후, 큐벳을 분광광도계에서 제거하고 용액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

3 M 아세트산 나트륨 5 µL와 100% 에탄올 125 µL를 첨가하여 반응을 정지시킵니다. 각 용액을 볼텍싱하여 혼합한 후, 배양 및 원심분리 전 단계로서 튜브를 -20 °C 냉동고에 1시간 동안 보관합니다. 반응 혼합물을 4 °C에서 11,000 G로 20분 동안 원심분리하고, 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

DNA 농축기를 사용하여 10분 동안 펠렛을 건조합니다. 20 µL의 겔 로딩 버퍼를 추가하고 짧게 볼텍싱합니다. 벤치탑 원심분리기로 짧게 원심분리하여 가라앉힙니다.

그 후 10% Dage 겔의 각 웰에 반응 시료 10 µL씩을 로딩합니다. 전기영동이 끝나면 유리판을 제거하고 수돗물로 깨끗이 세척합니다. 겔 조각을 제거하기 위해 Kim wipe로 유리판을 닦아냅니다.

Typhoon 스캐너를 사용하여 겔 플레이트의 형광을 스캔합니다. 시스템의 민감도를 평가하기 위해 이미지 정량 소프트웨어를 사용하여 결과 이미지를 분석합니다. 연속 희석된 배양액을 시간 간격을 두고 배양합니다.

단일 박테리아를 검출하는 데 필요한 최소 배양 기간을 결정하기 위해, 2 mL의 LB 배지가 담긴 배양 튜브 10개를 준비하십시오. 각 배양 튜브에 2 CFU/mL 농도의 E. coli 글리세롤 스톡 100 µL를 접종하고, 37 °C에서 250 RPM으로 흔들어 주며 4, 8, 12, 16, 24시간 동안 배양하십시오. 접종된 각 배양 튜브에서 300 µL를 수확하십시오. 4, 8, 12시간 시점에서 수확한 시료에서는 검출 가능한 박테리아가 없을 수도 있습니다.

박테리아가 포함된 배양물을 확인하기 위해 남은 배양액을 24시간 동안 배양합니다. OD 600을 측정하고 11,000 G에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 침전시킵니다. CEMS가 포함된 상층액을 새로운 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 다음 날 사용할 때까지 -20 °C에서 보관합니다.

배양액의 성장을 확인합니다. 접종 후 10개의 배양액 중 한두 개에만 e coli가 포함되어 있을 수 있으며, 나머지 튜브에는 세포가 포함되어 있지 않을 것입니다. 지정된 시점에 양성 배양액에서 회수된 CEMS를 사용하십시오. RFD EEC one을 이용한 절단 반응을 준비하고, 앞서 설명한 대로 DAGE 젤 전기영동을 사용하여 반응 혼합물을 분석합니다. RFD EEC one 및 RF SS one 프로브는 모두 DNA zyme 부분을 기질에 효소 결합시켜 준비하였습니다.

CEM EEC와 RFD EEC 1 또는 RF SS 1의 상호작용을 분광법으로 평가하였습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, CEM ec를 첨가했을 때 R-F-D-E-C 1에서 높은 수준의 형광 신호가 생성되었습니다.

이와 극명하게 대조적으로, R FS S one은 강한 형광 신호를 생성하지 않았습니다. 따라서 RFD EEC one의 형광 생성 기능이 CEM EC와 접촉했을 때 서열화됩니다.

관찰된 형광 증가가 RNA 연결부의 절단으로 인한 것임을 확인하기 위해 수행하였습니다. 반응 혼합물을 분석하였으며, 0.25 molar 수산화나트륨에 의한 RFD eec의 절단은 2D NA 단편, 즉 형광체가 포함된 5' 단편과 소광제가 포함된 3' 단편을 생성할 것으로 예상됩니다. 여기에서 확인할 수 있습니다.

RFD EEC CEM EEC 반응 혼합물에서 예상했던 절단 산물이 실제로 생성되었습니다. 또한, UNC만이 R-F-D-E-C를 절단하였으며, 5' 말단 단편이 형광 이미징을 통해 검출되었습니다. RFD EEC의 특이성을 확인하기 위해, 다른 여러 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에서만 수집한 CEMS를 사용하여 형광 분석을 수행하였습니다.

CEM EC가 포함된 샘플에서 형광 증가가 나타났습니다. 다른 박테리아 유래 CEMS와의 교차 반응성이 없다는 점은 R-F-D-E-C one이 E. coli에 대해 높은 선택성을 가짐을 나타냅니다. 단일 E. coli 세포를 검출하는 데 필요한 최소 배양 시간을 결정하기 위해, 1 mL당 1 CFU로 희석된 E. coli 100 µL를 성장 배지와 함께 4, 8, 12, 16, 24시간 동안 배양하였습니다. 생성된 CEMS를 R-F-D-E-C one과 혼합하였으며, 절단 여부를 여기와 같이 dage로 평가하였습니다.

Dage 분석 이미지를 통해 R-F-D-E-C 1에서 예상되는 절단 산물이 생성되지 않았음을 확인했습니다. CEM과 반응시켰을 때, 성장 4시간 및 8시간 시점에 수집한 ECS 결과는 숙련된 후에는 12시간의 배양 시간이 필요함을 나타냅니다.

이 기술의 핵심 요소는 적절하게 수행될 경우 DA 효소 기반 분석을 60분 이내에 완료할 수 있다는 점입니다. 이러한 개발 이후, 이 절차는 바이오 분석 분야의 연구자들이 광범위한 세균성 병원균 검출을 위한 알로제닉 DNA 효소를 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다.