휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

이 프로토콜의 전반적인 목표는 생체 내 현미경 검사(intravital microscopy)를 통해 마우스 뇌의 미세혈관 순환을 연구하는 것으로, 이를 통해 장기간에 걸쳐 모세혈관 미세순환의 혈역학적 및 염증성 마커의 동적인 변화를 추적할 수 있습니다. 이 기술은 La Jolla Bioengineering Institute에서 개발되었으며, 다양한 유형의 연구에 활용되었습니다. 예를 들어, plasmodium burgi onca 감염 과정 중의 혈역학적 변화 추적 및 뇌성 말라리아 발현 시점의 연구 등에 사용되었습니다.

이는 먼저 생체 내 현미경 연구 2주 전에 만성 두개창을 이식함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 저배율의 고해상도 디지털 이미지를 사용하여 두개창의 전체적인 형태를 기록하는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 일반 조명 및 형광 조명을 사용하여 생체 내 현미경 이미지를 획득하고, 혈관 직경과 RBC 속도의 실시간 측정을 위한 특정 연구 부위를 선택하는 것입니다.

절차의 마지막 단계는 형광 표지된 특이 항체를 통해 뇌혈관 내 백혈구 및 혈소판 부착의 생체 내 분석을 수행하는 것입니다. 최종적으로 뇌 생체 내 현미경 검사를 통해 생리적, 병리적 또는 질환 상태의 모델을 반영하는 뇌 미세 순환의 in vivo 변화를 관찰함으로써, 이러한 상태와 관련된 혈역학적 변화를 확인할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 외부 인자나 인공 배지에 노출시키지 않고 생리적 환경 내의 뇌를 관찰할 수 있다는 점이며, 자기공명영상(MRI) 및 혈관 조영술과 비교하여 공간 및 시간 해상도가 높아 미세 수준까지 관찰이 가능합니다.

이 방법은 급성 및 만성 질환 동안의 혈역학적 및 염증성 변화와 같은 뇌 미세순환의 생리학 및 병태생리학에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 생체 내 현미경 관찰 2~3주 전, 8~10주령 마우스를 대상으로 두개골 절제술을 수행하는데, 이는 기존에 입증된 방식과 동일하나 동물의 머리에 티타늄 바를 배치하지 않는다는 점이 다릅니다. 만성 두개창은 안정적인 준비 과정으로, 실험 당일뿐만 아니라 이식 후 수개월이 지난 후에도 뇌 미세순환을 관찰할 수 있게 합니다.

먼저, 동물을 스테레오택식 프레임(stereotaxic frame)에 고정하기 전에 체온을 확인하고, 이전에 준비한 형광 표지 적혈구를 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입합니다. 이를 통해 이후에 시연할 적혈구 추적이 가능해집니다. 그런 다음, 이소플루란(isoflurane)으로 마우스를 가볍게 마취합니다.

유도를 위해 4%, 유지 시에는 1~2%를 사용합니다. 다음으로, 가열 패드 위의 정위 고정 틀(stereotaxic frame)에 동물을 엎드린 자세로 놓습니다. 이어바(ear bars)를 사용하여 머리를 조심스럽게 고정하고, 좌우 레버를 사용하여 수평을 조절합니다.

미네랄 오일을 적신 면봉으로 두개창(cranial window)의 커버 슬립을 부드럽게 닦아냅니다. 그런 다음 디지털 카메라와 연결된 실체 현미경을 사용하여 창 아래의 혈관을 파노라마 사진으로 몇 장 촬영합니다. 파노라마 사진을 컴퓨터로 전송한 후, 출력하여 식별 및 날짜 표기를 할 가장 적절한 사진을 선택합니다.

이 사진은 다음 단계에서 생체 내 현미경 검사를 시작하기 위해 시연할 혈관 직경 및 적혈구 속도 측정의 지도로 사용됩니다. 마우스를 맞춤형 생체 내 현미경 스테이지로 옮기십시오. 치과용 아크릴로 형성된 홈을 이용하여 두개창 위에 물 한 방울을 떨어뜨리십시오.

개구수가 0.5인 20배 수침 대물렌즈를 사용합니다. 이미지는 컴퓨터 및 모니터에 연결된 디지털 저조도 고속 카메라와 VCR 테이프, 타임스탬프 및 컬러 모니터에 연결된 저조도 아날로그 카메라의 두 대의 카메라를 사용하여 기록합니다. 측정할 혈관을 선택하기 전에, 혈관들을 확인하여 표본의 품질을 평가하고, 모든 혈관에서 혈류가 흐르고 있다면 측정할 혈관들을 선택하십시오. 선택 대상에는 다양한 직경의 정맥과 동맥이 포함되어야 하며, 윈도우에 의해 노출된 영역 내의 서로 다른 위치를 포함해야 합니다.

본 실험에서는 두개창 내의 다양한 영역을 관찰하며 측정 대상 혈관 12개를 선택합니다. 혈관을 선택하기 위해, 앞서 촬영한 PY 혈관 사진에서 측정할 각 지점의 정확한 위치를 표시합니다. 각 지점의 혈관 직경은 이미지 시어(image shear) 장치를 사용하여 측정합니다. 지점이 선택되면 혈관 이미지를 수직 위치로 정렬하고, 반대편까지 이미지를 시어링합니다.

양 끝단을 맞추고 측정값을 기록합니다. 적혈주 추적을 위해, 디지털 카메라로 각 지점을 최소 30초 동안 촬영하며, 비디오 영상은 초당 150프레임으로 기록합니다. 이 속도는 최대 6 mm/s의 속도를 결정하기 위해 하나의 비디오 프레임당 세포의 이미지를 1~6장 얻을 수 있도록 설정된 것입니다.

데이터 수집이 완료되면, 마우스를 정위 고정 장치에서 분리하고 적절한 소프트웨어를 사용하여 마취에서 회복될 수 있도록 케이지로 되돌립니다. 획득한 비디오 이미지는 디지털화되며, 각 세포 이미지에 대한 XY 좌표 데이터를 얻습니다. 세포의 위치는 이미지 분석이 아닌 수동으로 결정합니다.

훈련된 관찰자의 육안은 세포 중심의 위치를 잘 추정할 수 있으며, 이는 일반적으로 관찰되는 최대 형광 위치와 일치합니다. 대부분의 세포 방향에 대해, 각 혈관당 15개 세포의 위치와 속도를 측정합니다. 혈관 직경과 RBC 속도 측정값이 확보되면, 평균을 내어 평균 RBC 속도를 구합니다.

각 혈관의 혈류량은 Q = (D/2)² × π × V 공식을 사용하여 계산할 수 있으며, 여기서 Q는 혈류량, V는 RBC 속도, D는 혈관 직경으로, 관류 평가 및 모세혈관 내 백혈구 부착 분석에 사용됩니다. 생체 내 현미경 관찰은 FSE 표지 알부민과 Texas Red로 표지된 범백혈구 마커 CD 45 항체 혼합물을 주입한 동물에서 수행됩니다. 형광 표지된 알부민은 관통 혈관을 포함한 혈관 네트워크의 시각화를 개선하며, 특히 뇌 말라리아와 같은 질환 상태에서 관류되지 않거나 관류가 부족한 혈관을 확인하는 데 유용합니다.

형광 표지된 anti CD 45 항체를 사용하면 백혈구가 혈관에 부착하거나 굴러가는 현상을 쉽게 식별하고 정량화할 수 있습니다. 백혈구 부착의 정량화는 100 micron 혈관 길이 내의 백혈구 수를 측정하여 수행합니다. 굴러가는 현상은 동일한 100 micron 길이 내에서 30초 동안 혈류 속도보다 현저히 느린 속도로 이동하는 백혈구의 수를 세어 정량화합니다. 제시됨.

다음은 고속 형광 촬영의 세포 추적을 통한 미세혈관 내 적혈구 속도 측정의 예시입니다. 비디오 녹화 영상의 사진 A부터 F는 미세순환의 연속 이미지입니다. 각 사진은 고속 카메라에 의해 프레임별로 캡처된, 흐르고 있는 단일 적혈구의 위치를 나타냅니다.

대표적인 실험 결과인 이 그래프는 시간에 따른 뇌혈류의 변화를 보여줍니다. plasmodium, burgi, onca에 감염된 마우스의 경우, 대조군 마우스의 뇌혈류가 시간에 따라 비교적 안정적인 반면, PBA에 감염된 마우스는 뇌 말라리아가 발생하는 시점에 혈류량이 현저히 감소하는 양상을 보입니다.

6일 차에 anti CD 45, Texas red 형광 항체로 염색하여 관찰한 결과, plasmodium burgi onca에 감염된 마우스의 모세혈관에 다수의 백혈구가 부착되어 있음을 알 수 있습니다. 이 절차는 오늘 다루는 작업 외에도 광범위하게 응용될 수 있습니다. in vivo에서 사용 가능한 모든 광학 기술을 이 모델에 적용할 수 있으며, 조직, 조직 내 산소 농도, pH, 활성 산소종 및 백혈구와 내피세포의 상호작용과 같은 파라미터를 이 모델을 통해 연구할 수 있습니다.