두개골의 창문을 통해 네크로 텍스의 혈류의 2 광자 이미징을위한 방법

살아있는 설치류의 온전한 뇌에서 뇌혈관을 영상화하고 혈류 역학을 기록하는 능력은 뇌허혈 또는 정상적인 뇌 생리학 연구에 적용될 수 있는 강력한 기술입니다. 본 영상에서는 꼬리 정맥에 주입된 형광 염료를 사용하여 살아있는 마우스의 신피질 내 혈류 역학을 영상화하기 위한 이광자 현미경 사용법을 시연하겠습니다. 이 기술은 원래 David Kleinfeld와 Winfred Dank에 의해 개발되었습니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 신경과 Carlos Porter Cayo 연구실의 Ricardo Mota입니다. 이전 영상에서는 생체 내(in vivo) 만성 이미징 실험을 위한 두개창(cranial window) 이식 방법을 보여드렸습니다. 오늘은 두개창을 통해 대뇌 피질의 혈류 역학을 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다.

이 표본 제작법은 이광자 레이저 현미경을 사용하여 뇌 심부를 이미지화할 수 있어 매우 유용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 뇌혈관을 이미지화하려면 동물에게 형광 염료를 정맥 주사해야 합니다.

덱스트란 모이어티(dextran moiety)가 염료의 혈뇌장벽(blood-brain barrier) 통과 및 혈관 외부 누출을 방지하기 때문에 Dexter 결합 염료를 사용합니다. 마우스는 이소플루란(isoflurane)을 사용하여 마취하며, 도입 시에는 4%, 주입 중에는 1.5~2% 농도를 유지합니다. 그다음, 70% 알코올을 묻힌 솜으로 꼬리를 세 번 닦아 소독한 후, 26 gauge 바늘을 사용하여 생리식염수에 용해된 5% Rhodamine Dextran 용액 75~100 µL를 꼬리 정맥을 통해 주입합니다.

꼬리 정맥 주사 직후부터 염료가 소변으로 배출될 때까지 꼬리 축의 중간 지점에서 동물을 이미징할 수 있으며, ERO domine 염료를 사용하는 경우 소변 색이 분홍색으로 변합니다. 형광 Dexter 염료 주사 후 약 2시간이 지나면, 마우스에 isof fluorine을 투여하여 마취시킵니다. 유도 시에는 4%, 이미징 시에는 1~1.5%를 사용합니다. 마우스는 티타늄 바를 사용하여 현미경 스테이지에 단단히 고정하며, 스테이지에는 동물의 체온을 유지하기 위한 온도 조절 가열 패드가 포함되어 있습니다.

안구를 촉촉하게 유지하기 위해 안연고를 도포합니다. 두개창(cranial window)의 커버 글라스를 70% 알코올로 세척합니다. 윈도우를 초점 평면과 평행하게 배치하고 시야의 중심에 맞춥니다.

4x 대물렌즈 하에서 디지털 카메라를 사용하여 뇌 표면 혈관의 사진을 촬영하는 것이 가장 좋습니다. 이 사진은 이후의 영상 촬영 세션에서 매일 동일한 영상 영역을 반복적으로 찾기 위한 참조 이미지로 사용됩니다. 그 다음 4x 대물렌즈를 수침식 40x 대물렌즈로 교체합니다.

스테이지를 이동하지 않은 상태에서 시야의 디지털 이미지를 촬영합니다. 다시 스테이지 조작기의 좌표를 0으로 설정합니다. 이미지 획득 소프트웨어로는 scan image를 사용합니다.

본 프로그램은 Carls Voto 연구실의 Tom Paul Rudo와 Bernardo Sabatini가 MATLAB으로 작성하였습니다. 다음으로 레이저, 파워 미터, 광전증배관, 증폭기 등 나머지 모든 장비를 켭니다. 이미지 촬영에 적합한 윈도우 영역을 저배율로 간단히 스캔하여 최적의 영역을 찾습니다.

해당 영역들이 식별되면, 촬영할 선택 영역의 저배율 스택을 획득하고 XY 좌표를 기록하여 소혈관 또는 모세혈관의 혈류 역학을 기록합니다. 관심 혈관을 따라 최소 40 µm 구간에 대해 라인 스캔을 수행합니다. 1초 동안 지속되는 이러한 단일 스윕은 가능한 한 낮은 레이저 출력을 사용하여 수행하며, 스캔 좌표와 각도를 기록합니다.

이미징 세션이 끝나면, 동물은 마취에서 회복할 수 있도록 온열 챔버로 이동됩니다. 여기서는 꼬리 정맥을 통해 r Domine dextran을 주입한 5개월령 마우스의 체성감각 피질 위에 설치된 두개창을 통해, 이광자 현미경으로 5 µm 간격으로 촬영한 100장의 이미지 스택을 보여줍니다. 이 일련의 이미지들은 모세혈관을 포함하여 크고 작은 혈관들의 복잡한 네트워크를 보여줍니다.

지금까지 두개창을 통해 생체 내 혈류 역학을 시각화하는 방법을 살펴보았습니다. 이는 피질 혈관의 뇌혈류 역학을 이미징하는 매우 강력한 방법으로, 예를 들어 뇌졸중 후 혈류 변화를 조사하는 데 활용될 수 있습니다. 형광 염료를 꼬리 정맥에 반복적으로 주입함으로써 다양한 시간대의 BUL에서 여러 차례 이미징을 수행할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때는 가능한 한 가장 깨끗하고 멸균된 환경에서 작업하고, 손을 매우 안정적으로 유지하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마쳤습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.