에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 2차원 젤 분석을 사용하여 복제가 DNA 손상에 부딪혔을 때 발생하는 DNA 구조 중간체를 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 복제 차단 손상이 유도된 활성 분열 세포에서 DNA를 분리함으로써 수행됩니다. 그 후, 젤 전기영동을 사용하여 회수된 DNA를 크기별로 분리합니다.

다음으로, 레인을 절단하여 두 번째 젤에 수평으로 다시 굳히는데, 이는 크기와 모양 모두에 기초하여 DNA를 추가로 분리하기 위함입니다. 마지막으로, Southern 분석을 통해 UV 유도 손상 도입 전과 도입 후 다양한 시점에서 복제 중인 DNA 단편과 연관된 DNA 구조를 시각화합니다. 궁극적으로, 이 절차는 특정 돌연변이체에서 DNA 병변을 처리하지 못하는 능력이 DNA 수선 중간체의 축적으로 이어진다는 것을 보여주는 데 사용될 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Arthur Ian입니다. 저는 포틀랜드 주립대학교의 Corella 연구실 소속입니다. 안녕하세요, 제 이름은 Brand she이며, 저 또한 Corella 연구실 소속입니다.

오늘은 2차원 겔 전기영동 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 DNA 복제 및 복구 중간체를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하려면, ampicillin이 포함된 DGC thigh 배지에서 PBR 3 22 플라스미드를 포함하는 e coli를 37 °C에서 200 µL 규모로 하룻밤 동안 배양하십시오. DGC thigh 배지를 사용하면 UV 차폐를 최소화할 수 있습니다. 하룻밤 배양 후, 세포를 14,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 펠렛으로 만드십시오.

그런 다음 세포 펠렛을 ampicillin이 포함되지 않은 200 µL의 DG C th 배지에 다시 현탁하여 접종합니다. ampicillin 선택 압력이 없는 20 mL의 DG C thigh 배지를 사용하여, 37 °C의 진탕 배양기에서 OD 600이 0.5(mL당 약 5×10⁸ cells에 해당)가 될 때까지 배양합니다. ampicillin 없이 배양하면 일부 돌연변이체에서 발생할 수 있는 비정상적이거나 비생산적인 복제 중간체에 대한 선택적 소실을 방지할 수 있습니다.

또한, UV 광선을 사용하여 손상을 유도하는 경우, ampicillin이 해당 파장에서 강하게 흡수되어 세포를 보호함으로써 UV의 유효 선량을 감소시키기 때문에 배지에서 ampicillin을 제거해야 합니다. UVC 광도계를 사용하여 m²당 초당 약 1 J/m²·s의 노출률을 생성하는 15W 살균 램프로부터의 거리를 결정하십시오.

UV 조사 후 포토라이아제(photo liase)에 의한 사이클로부탄 피리미딘 이량체(cyclo butane perine dimers)의 광재활성화를 방지하기 위해, 이후 단계는 황색광 아래에서 수행해야 합니다. 원하는 세포 밀도에 도달하면, 피펫을 사용하여 배양물을 회전 플랫폼 위의 직경 15 centimeter 페트리 접시로 옮겨 전체 세포 집단에 균일하게 조사가 이루어지도록 합니다. 다음으로, 배양물에 50 joules per meter squared로 조사한 후 즉시 멸균된 예열 플라스크로 옮겨 37 degrees Celsius 진탕 배양기에 다시 넣습니다.

실험 기간 동안, 이 용량은 분석 대상이 되는 각 시점마다 단일 가닥 DNA 4.5 kb당 평균적으로 하나의 사이클로부탄 피리미딘 이량체(cyclo butane pyrimidine dimer)를 생성합니다. 배양액 0.75 mL 분량을 얼음처럼 차가운 net 30 완충액 0.75 mL에 피펫으로 옮깁니다. net 30 완충액은 복제 및 뉴클레오타이드 절제 복구가 진행되는 것을 방지하는 정지 완충액 역할을 합니다.

스톱 버퍼(stop buffer)를 첨가한 후, 시료는 타임 코스가 종료될 때까지 얼음 위에 보관할 수 있습니다. 타임 코스가 완료되면 각 시료를 펠렛화하고 펠렛을 재현탁합니다. 150 µL의 용해 버퍼(lysis buffer)를 사용하여 37 °C에서 20분 동안 교반 없이 세포를 용해합니다.

단일 가닥 영역이나 분기점이 있는 복제 구조는 전단력에 더 취약하므로, 면도날로 피펫 팁의 끝을 잘라 입구를 넓게 만들어 전단력을 최소화하십시오. 일반적으로 제한 효소로 DNA를 소화하기 전까지는 피펫팅과 교반을 최소한으로 유지해야 합니다. 용해 후, proteinase K와 sarcas cell을 첨가하고 1시간 동안 배양을 계속하십시오. 이는 단백질과 결합된 DNA 단편을 방출시키는 역할을 합니다.

활발하게 복제 중인 DNA는 종종 단백질 또는 막 복합체에 결합되어 있으므로, 이 과정은 복제 단편의 수득량을 높이는 데 도움이 됩니다. 1시간 후, 각 샘플에 2배 부피의 페놀을 첨가하고 튜브를 5분 동안 부드럽게 뒤집어 샘플을 추출하십시오. 그런 다음 2배 부피의 클로로포름, 이소아밀 알코올을 첨가하고 다시 5분 동안 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞으십시오.

다음으로, 마이크로 원심분리기를 사용하여 샘플을 14,000 RPM에서 5분 동안 원심분리한 후, 각 샘플의 상층 수성층을 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 4배 부피의 클로로포름-이소아밀 알코올을 첨가하고, 다시 튜브를 5분 동안 부드럽게 전도 혼합합니다. 샘플을 14,000 RPM에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.

비커에 담긴 250 milliliters의 0.1 xte 위에 투석막을 놓고, 막 위에 각 샘플 100 microliters를 점적합니다. 투석 후 1시간 동안 샘플을 투석시킵니다. 20 microliters의 효소 혼합액이 들어 있는 새로운 1.5 milliliter 튜브에 각 샘플 80 microliters를 넣습니다.

시료를 37 °C에서 밤새 소화시킵니다. PV two는 복제 원점 바로 하류에서 플라스미드를 선형화합니다. 아가로스 겔에 로딩하기 전, 클로로포름 100 µL와 bromo가 포함된 6 x 로딩 다이 20 µL를 첨가합니다.

각 샘플에 페놀 블루와 자일렌 시안을 첨가하고 혼합합니다. 클로로포름은 DNA 말단에 결합된 잔류 PV two를 제거합니다. 제한 효소 처리된 DNA 샘플을 1차 차원으로 전기영동하여 2차원 아가로스 겔 분석을 시작합니다. 먼저, 이전에 준비한 1x TBE 내의 0.4% 아가로스 겔의 첫 번째 레인에 Lambda hind three 크기 마커를 로딩합니다.

그다음 각 샘플에 대해 로딩 다이(loading dye)가 포함된 수성 상 40 µL를 로딩하며, 겔 절단(gel slicing)을 용이하게 하기 위해 레인을 띄워줍니다. 전기영동 후, 1차원 분리를 위해 1 V/cm의 전압으로 약 12~15시간 동안 가동합니다. 낮은 전압과 낮은 농도의 AGROS 겔은 주로 크기에 따라 DNA 단편을 분리하는 역할을 합니다.

1차 전기영동이 완료되면, 대형 정육 칼을 사용하여 Lambda hind three 마커가 포함된 첫 번째 레인을 잘라내고 브로모이드(atherium bromide)로 염색합니다. 2차 전기영동을 위해, Lambda Hind three 마커를 가이드로 삼아 대형 정육 칼로 겔 레인을 절단하고, 각 레인에서 선형화된 플라스미드가 나타날 것으로 예상되는 지점 아래 영역은 잘라내어 폐기합니다. 2차 전기영동용 겔을 제작하려면, 각 절단편을 빈 겔 캐스터 상단에 가로로 배치합니다.

XTBE 1개에 1% AROS 용액을 조제하고 55°C까지 식힙니다. 충분히 식으면 2차원 전개용 젤을 캐스팅하기 위해 젤 용액을 붓되, 젤 슬라이스가 완전히 덮이도록 합니다. 젤을 붓기 전에 슬라이스가 균일하게 배치되었는지와 캐스터의 수평 상태를 확인하는 것이 중요합니다.

겔이 굳으면, 버퍼가 재순환되는 전기영동 장치에서 6.5 vols/cm의 전압으로 5.5~7시간 동안 2차원 전기영동을 수행합니다. 고전압과 고농도 Agros 겔은 DNA 단편을 크기뿐만 아니라 형태에 따라 효과적으로 분리합니다. 비선형 형태의 단편은 전기영동 후 2차원상에서 더 느리게 이동합니다. 겔을 물로 한 번 헹군 다음, 0.25 M 염산 400 mL에서 완만하게 교반하며 15분 동안 두 번 세척합니다.

산 세척은 DNA 분자를 부분적으로 닉(nick)하여 더 작은 단편으로 나누는 역할을 하며, 이는 서던 분석 시 전이 효율을 높이기 위함입니다. 또한, DNA 복제 중간체의 크기가 크고 형태가 특이하기 때문에 이 과정이 필수적입니다. 알칼리 전이를 위해 겔을 준비하려면, 겔을 물로 다시 헹군 다음 0.4 molar 수산화나트륨 400 milliliters에서 30분 동안 두 번 세척합니다. 그 후, 본 절차의 서면 부분에 기술된 대로 0.4 molar 수산화나트륨을 사용하는 하향식 알칼리 전이 시스템을 이용하여 겔 내의 DNA를 high bond n plus 나일론 막으로 전이시킵니다. DNA 전이를 6~12시간 동안 진행한 후, 서면 프로토콜에 안내된 대로 프로브 하이브리드화를 이어서 수행합니다.

멤브레인의 프로빙과 세척이 완료되면, 액체가 눈에 띄게 사라질 때까지 멤브레인을 페이퍼 타월 위에 올려둡니다. 그 다음 멤브레인을 폴리염화비닐(polyvinyl chloride) 플라스틱 랩으로 감싸고 포스포이미저 스크린에 노출시킵니다. 마지막으로, storm eight 40 및 관련 image quant를 사용하여 방사능을 시각화하고 정량화할 수 있습니다.

2D agarose 겔 분석으로 관찰한 PvuII로 절단된 pBR322 플라스미드의 이동 패턴을 도식화하였습니다. 비복제 선형 플라스미드는 4.4 KB의 선형 단편으로 이동하며, 복제 중인 플라스미드는 Y자형 구조를 형성하여 더 큰 크기와 비선형 모양으로 인해 비복제 단편보다 느리게 이동합니다. 이러한 이동 패턴은 UV 조사 후 선형 영역에서 웰(well) 방향으로 뻗어 나가는 호(arc) 형태를 이룹니다.

원추 영역에서 이중 Y형 또는 X형 분자들이 관찰되며, 이들은 Y형 분자들의 호(arc)보다 더 느리게 이동합니다. UV 조사 직후 및 UV 조사 15분 후의 세포에 대해 P 32로 표지된 PBR 3 22로 프로빙한 2D 젤의 남쪽 분석 예시가 나타나 있습니다. 조사 후 세포가 지수 성장기에 빠르게 성장할 때, 전체 플라스미드 DNA의 약 1%가 Y 호에서 발견될 수 있습니다.

손상된 부위에 차단된 복제 포크가 축적됨에 따라 Y-형 분자의 일시적인 증가가 관찰됩니다. L-형 복제 중간체 또한 일시적으로 축적되며, 병변이 복구되는 시점과 상관관계가 있을 때까지 지속됩니다. 지금까지 2차원 젤 전기영동을 사용하여 DNA 복구 중간체를 시각화하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, 수율을 감소시킬 수 있는 전단력에 주의하고 모든 시료와 젤을 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.