X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

본 절차의 전반적인 목표는 X-선 회절 실험을 위한 단백질 결정을 생성하는 것입니다. 결정 스크리닝을 위한 세 가지 서로 다른 기술이 시연되며, 증기 확산 결정화 방법인 행잉 드롭(hanging drop) 및 시팅 드롭(sitting drop) 방식과 더불어 증기 확산 결정화를 위한 마이크로 배치(micro batch) 결정화 방법이 설명됩니다. 웰(well)은 침전제로 채워집니다.

그 다음, 고농도의 정제된 단백질 샘플을 침전제와 혼합합니다. 혼합된 액적을 침전제 용액이 들어 있는 웰에 넣고 밀봉합니다. 웰을 파라핀 오일로 채우면 마이크로 배치 결정화가 시작됩니다.

그다음 단백질을 웰에 로딩하고, 이어서 침전제 용액을 넣습니다. 모든 방법의 마지막 단계는 시스템이 평형을 이루도록 두고 드롭 내에서 결정의 생성 및 성장을 관찰하는 것입니다. 결과적으로 이 기술을 통해 결정을 얻을 수 있으며, 적절한 검출기가 장착된 x-선원을 사용하여 단백질 회절 패턴을 결정할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 예일 대학교 분자생물물리학 및 생화학과의 Yoga Motis 교수님 연구실의 Sal입니다. 오늘은 정제된 단백질의 결정화 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 바이러스 감염의 구조적 기반을 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.

그럼 이제 시작해서 결정을 성장시켜 보겠습니다. 선택한 거대분자의 결정화 방법을 확인하기 위해, 희소 행렬 불완전 요인 설계법(sparse matrix incomplete factorial method)의 실험 조건을 활용하도록 선정된 상용 결정화 용액을 사용하여 초기 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 이러한 조건들은 거대분자에 대해 알려져 있으며 일반적으로 성공적이었던 결정화 조건들을 바탕으로 선택됩니다.

결정화 조건이 확인되면, 원래의 히트(hit) 조건 주변에서 pH와 침전제 농도를 변화시켜 좁은 범위의 스크리닝을 구성할 수 있습니다. 일반적으로 이러한 스크리닝에 사용되는 결정화 조건은 침전제와 pH를 설정하기 위한 완충액으로 구성되며, 본 시연에서는 모든 스톡 솔루션을 0.22 micron 필터로 여과해야 합니다. 닭 리소좀에 대해 이전에 확인된 결정화 조건을 사용하며, 침전제로는 sodium chloride를 사용합니다. 다양한 pH의 0.1 molar sodium acetate에 다양한 농도의 sodium chloride를 녹여 1 mL 용액들을 준비함으로써 절차를 시작하십시오.

다음으로 -80 °C에 보관된 단백질 샘플을 해동하여 얼음 위에 둡니다. 일반적인 단백질 농도는 5~50 mg/mL 범위이며, 농도가 높을수록 보통 더 좋은 결과가 나타납니다. 본 실험에서는 0.02 M sodium acetate pH 4.9에 용해된 50 mg/mL 농도의 닭알 리소자임 용액을 사용합니다.

해동 단계에서 발생한 일부 응집 단백질이나 침전물을 제거하기 위해 샘플을 18,000 G, 4 °C에서 15분 동안 원심분리합니다. 이러한 응집체는 결정 성장을 방해하고 추가적인 응집을 촉진할 수 있습니다. 원심분리 후,

UV 분광 광도계를 사용하여 280 nanometers에서의 흡광도로 단백질 농도를 결정합니다. 단백질 농도는 흡광도 측정값과 단백질의 소멸 계수를 통해 계산할 수 있습니다. 단백질 샘플이 준비되면, 트레이 맵에 따라 24-well hanging sitting drop 결정화 트레이에 침전제 용액 500 microliters를 채웁니다.

각 웰의 가장자리를 따라 실리콘 그리스 링을 만듭니다. 이때 공기가 웰 천장 밖으로 빠져나갈 수 있도록 링을 완전히 닫지 마십시오. 커버 슬라이드를 압축 공기 스프레이나 전용 와이프로 닦아 먼지를 제거하십시오. 이렇게 하면 결정화 드롭의 해석이 용이해지고 오염을 방지할 수 있습니다. 다음 단계는 단백질 샘플과 리저버 용액을 동일한 부피로 커버 슬라이드 위에 피펫팅하는 것입니다.

하지만 최적화 과정의 일환으로 단백질과 침전제의 부피를 다양하게 시도할 수 있으며, 침전제보다 단백질을 더 많이 사용하면 평형 상태의 액적 내 단백질 농도가 높아지는데, 이는 희석된 단백질 샘플의 경우나 결정의 핵 형성 또는 성장을 늦추고자 할 때 유리할 수 있습니다. 본 시연에서는 0.02 M sodium acetate(pH 4)에 녹인 50 mg/mL lysozyme 2 µL를 커버 슬라이드 중앙에 분주한 후, 결정화 용액 2 µL를 이어서 분주합니다.

단백질과 저장 용액을 커버 슬라이드 위에 피펫팅할 때, 피펫에서 공기가 배출될 때 흔히 발생하는 기포가 생성되지 않도록 각별히 주의하십시오. 액적 내의 국소적으로 높은 침전제 농도로 인해 단백질이 조기에 침전되는 것을 방지하기 위해 액적을 부드럽게 섞어주십시오. 특히 polyethylene glycol과 같이 점성이 있는 침전제를 사용할 때는 핀셋을 사용하여 섞어주는 것이 매우 중요합니다. 커버 슬라이드를 조심스럽게 뒤집어 웰 상단의 그리스 링 위에 놓으십시오. 이때 공기가 웰 밖으로 빠져나갈 수 있도록 한쪽 방향으로 밀어 넣듯 수행하십시오.

그렇지 않으면 공기가 커버 슬라이드를 들어 올려 웰 밀봉을 손상시킬 수 있습니다. 트레이 작업이 완료될 때까지 다음 웰로 이동하십시오. 트레이 설정이 완료되면 육안으로 검사하여 단백질 결정의 위양성 식별을 줄일 수 있는 먼지 입자 및 기타 오염 물질을 제거하십시오.

점수 기록지를 사용하여 실험 내용을 기록하십시오. 다음으로, 트레이를 일반적으로 4 °C에서 상온 사이의 원하는 배양 온도에 둡니다. 가장 적절한 온도는 20 °C입니다.

트레이를 운반하거나 배양하는 동안 조심스럽게 다루고, 흔들림, 진동 또는 온도 변화를 피해야 결정 성장이 억제되거나 결정의 품질에 부정적인 영향을 주는 것을 방지할 수 있습니다. 다음 날부터 며칠 간격으로 트레이 내 결정 형성 여부를 확인하되, 항상 주의해서 다루십시오. 발견 사항과 드롭 형태(morphology)를 트레이 전용 채점 시트에 기록하십시오.

결정은 보통 2~5일 후에 나타나지만, 때로는 거의 즉시 나타나거나 최대 몇 달 후에 나타나기도 합니다. 결정화 조건이 확인되고 결정의 성장 속도를 알게 되면, 결정이 나타나 최종 크기의 최소 절반까지 성장할 때까지 트레이를 건드리지 않고 그대로 두는 것이 가장 좋습니다. 트레이를 건드리지 않고 두면 결정 핵 생성 횟수를 줄일 수 있어, 결과적으로 더 적은 수의 더 큰 결정을 얻을 수 있습니다. 시팅 드롭(sitting drop) 결정화는 커버 슬라이드가 필요 없는 24웰 시팅 드롭 트레이를 사용한다는 점을 제외하고는 행잉 드롭(hanging drop)과 동일한 절차를 따릅니다.

대신, 웰에는 단백질과 침전제를 혼합하는 선반이 있습니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 50 mg/mL lysozyme 용액 2 µL를 선반 중앙에 피펫으로 분주합니다. 그 다음, 트레이 설정 후 샘플에 침전제 용액 2 µL를 추가합니다. 시팅 드롭(sitting drop) 방식의 웰을 광학 테이프로 밀봉합니다.

커버 슬라이드는 필요하지 않습니다. hanging drop 방식에서 설명한 것과 동일하게 배양 및 결정 점수 측정을 계속 진행하십시오. micro batch 절차를 수행하려면 다음과 같이 합니다.

현수적정법(hanging drop procedure)에서 설명한 것과 같이 결정화 용액과 단백질을 준비합니다. 새로운 마이크로 배치 트레이를 준비하고 에어 스프레이로 청소하여 트레이 내의 먼지 및 기타 거대 입자를 제거합니다. 각 웰에 파라핀 오일을 3mm 깊이로 채웁니다.

그다음 과량의 오일을 제거합니다. 이어서 단백질 용액 1 µL를 미리 채워진 웰에 분주하고, 액적이 웰 바닥까지 가라앉았는지 확인합니다. 그다음 침전제 용액 1 µL를 웰에 분주합니다.

방울이 웰 바닥까지 가라앉아 단백질 액적과 융합되었는지 확인하십시오. 트레이의 모든 웰을 채울 때까지 다음 웰로 이동하며, 이후 여기에서 설명한 대로 배양 및 결정 분석을 계속하십시오. 단백질 결정화의 전형적인 결과물들.

실험 결과가 제시되어 있습니다. 단백질 또는 침전제의 농도가 높을 때 무정형 침전이 발생합니다. 반대로, 불포화 상태의 드롭은 대개 투명한 상태를 유지합니다.

고농도에서 특정 침전제와 혼합되었을 때 단백질이나 계면활성제가 다른 상으로 분리되면 상분리가 발생할 수 있습니다. 최적의 조건 하에서 Arabidopsis csn 단백질 결정이 형성되어야 합니다. polyethylene glycol 8,000과 magnesium acetate에서 얻은 7개의 단백질 결정은 막대 모양으로 나타납니다.

함께 제시된 결정은 1 M NaCl과 sodium acetate, pH 4.9 조건에서 얻은 리소좀 단백질 결정입니다. 이 타임랩스 영상은 행잉 드롭(hanging drop)법을 사용했을 때 리소좀 결정이 설정 후 몇 시간 이내에 거대한 프리즘 형태로 성장하는 과정을 보여줍니다.

본 절차를 수행할 때 단백질 실험을 설정하는 방법을 살펴보았습니다. 온습도가 일정하게 제어되는 환경에서 작업하는 것이 중요하며, 높은 습도는 액적 증발을 최소화하는 데 도움이 되므로 액적이 외부 공기에 노출되는 것을 최소화하는 기술을 적용하십시오. 이러한 이유로 잘 정리된 작업 환경에서 수행하는 것이 필수적입니다.

여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.