싱크로 트론 - X - 레이 - tomography를 사용하여 서브 마이크론 해상도로 비침습 3D - 시각화
2008년 5월 27일
우리는 비 invasively 0.7μm의 픽셀 해상도와 3D 단층 데이터 세트를 생산하는 유럽 싱크로 트론 방사선 시설 (ESRF)에 싱크로 트론 X - 선 tomography를 사용했습니다. 볼륨 렌더링 소프트웨어를 사용하여이 histological sectioning 제작한 공예품없이 자연 상태에서 내부 구조의 재건 수 있습니다.
안녕하세요. 저는 튀빙겐 대학교 Bats Lab의 Michelle Ov이며, 이번 발표에서는 서브마이크론 해상도의 싱크로트론 X선 단층촬영을 이용한 마이크로 AHR 폿의 내부 구조에 대한 비침습적 3차원 시각화에 대해 말씀드리고자 합니다. 저희가 연구하고 있는 모델 시스템은 몸길이가 800 µm에서 1 mm인 마이크로 COLYER AHR 폿인 진드기 *A. longosis*입니다. 이것은 저희 실험실 배양 상태에서 찍은 사진으로, 동물들이 조류를 섭식하고 있는 모습을 보실 수 있습니다.
Argos의 내부 조직을 연구하기 위해, SRF 및 Grable에서 싱크로트론 X선 방사선을 사용하여 단층 촬영 VOX 데이터를 생성합니다. 여기 ESRF의 대형 저장 링 사진이 있으며, 오른쪽 상단 모서리에는 링 외부에 위치한 ID 19의 실험실이 보입니다. 측정을 위해 샘플을 정밀하게 정렬하고 순간접착제를 사용하여 플라스틱 핀에 고정했습니다. 실험은 20.5 KEV에서 수행되었으며, 재구성을 위해 1,500장의 투영 영상을 촬영했습니다.
여기 14비트 다이내믹 레인지와 4백만 화소를 갖춘 공동 프리랜스 CCD 칩 카메라가 보입니다. 사진 하단에 표시된 시뮬레이터는 X선을 가시광선으로 변환합니다. 이것은 시료 홀더와 회전 테이블을 확대한 모습입니다.
빔 내에서 시료의 방향을 적절하게 설정하기 위해 시료를 Goya 측정기 헤드에 장착합니다. 실험 설정에 대한 자세한 설명은 Journal of Microscopy에 게재된 2007년 논문에 나와 있습니다. 본 발표에서는 Fiji Studio Max 소프트웨어를 이용한 3차원 시각화와 관련하여 데이터 분석기에 중점을 두어 설명하겠습니다.
먼저, 샘플 정보를 추출하기 위해 배경에서 회색조 값을 제거하는 방법을 보여드리겠습니다. 히스토그램을 보면 하나의 큰 피크가 나타나는데, 이는 주로 배경의 회색조 값에 해당합니다. 히스토그램에서 이 피크를 제거하면 회색 큐브에서 샘플이 드러나는 것을 확인할 수 있습니다.
다음으로, 키 프레이머(key framer) VG studio를 사용하여 객체를 회전시키는 방법을 보여드리겠습니다. Max에는 사전 정의된 카메라 궤적이 설정되어 있습니다. 여기서는 XY 원을 사용하여 수직 Xs축을 중심으로 회전시켜 최종 애니메이션을 생성하겠습니다.
동물의 뒷면에 있는 커다란 구조물은 순간접착제의 표면에 해당합니다. 이제 샘플의 내부 조직을 3차원적으로 살펴볼 수 있도록 가상 절단면을 설정하는 방법을 보여드리겠습니다. 절단면은 전면, 측면, 수직의 세 가지 방향으로 설정할 수 있습니다.
여기서는 관상면(frontal plane)을 사용하여 동물의 중간 지점인 이 부위에서 절단 위치를 정합니다. 이 절단면은 고정될 필요가 없습니다. 다시 키 프레이머(key framer)를 사용하여 어떤 축을 따라든 이동시킬 수 있습니다. 이 예시에서는 프리셋 clip Z를 사용하여 시료의 장축을 따라 절단면을 이동시켰으며, 최종 애니메이션이 단계별로 어떻게 나타나는지 확인할 수 있습니다. 이를 통해 단 0.7 microns의 분해능으로 모든 내부 구조의 3D 조직 구성을 관찰하고 따라갈 수 있습니다.
사전 정의된 카메라 궤적 외에도 사용자 지정 카메라 경로를 생성할 수 있습니다. 이를 위해 자유 카메라 뷰 모드를 선택하고 카메라와 가상 렌즈의 초점 거리를 원하는 위치로 조정하십시오. 단계별로 새로운 카메라 위치를 정의하여 복잡성에 관계없이 개별 경로를 따라갈 수 있습니다.
왼쪽 상단의 3D 창은 모든 카메라 설정의 효과를 실시간으로 보여줍니다. 마지막 예제에서는 동물의 전체 소화 기관을 따라가는 가상 비행을 통해 내부를 살펴봅니다. 여기에서 gma, colliery, labrum 및 rotella의 일부를 확인할 수 있습니다.
더 가까이 다가가 동물의 입으로 들어갑니다. 여기에서 등쪽의 PHN을 볼 수 있습니다. 이제 식도를 지나 심실로 들어갑니다.
우리가 연구한 진드기에는 두 개의 커다란 ker가 있습니다. 이것들은 소화 기능을 가진 slice 구조입니다. 우리는 오른쪽 seum으로 들어갑니다.
작은 개구부를 통해 수많은 IDE 세포를 관찰할 수 있습니다. 이러한 세포들은 소화 과정에서 중요한 역할을 하지만, 전체적인 기능과 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 다시 심실로 돌아가면, 조금 전 심실로 진입했을 때 지나온 특정 구조인 이살 밸브(Isal valve)를 볼 수 있는데, 이는 심실과 결장의 경계에 위치하고 있습니다.
위축된 막으로 둘러싸여 응축된 먹이 덩어리를 볼 수 있습니다. 먹이 덩어리 뒤로는 분변 펠릿이 보입니다. 현재 우리는 이 분변 펠릿 내부를 통과하고 있습니다.
그 후, 짧은 결장 입구를 지나 후결장으로 진입합니다. 여기서 크고 특징적인 미생물 군집을 볼 수 있습니다. 마지막으로, 마치 팔레트처럼 보이는 특정 동물 판의 내면을 여기서 확인하실 수 있습니다.
이제 소화계를 벗어나 동물의 외측 복면을 짧게 마지막으로 살펴보며, 동물판(animal plates), AAL 판(AAL plates), 그리고 생식판(genital plates)을 확인하겠습니다.
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개요
본 연구는 싱크로트론 X선 단층 촬영을 이용하여 마이크로 AHR 결과물의 내부 구조를 시각화하는 비침습적 방법을 제시합니다. 이 기술은 기존의 조직학적 방법과 관련된 아티팩트 없이 고해상도 3D 이미징을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 이미징 기술
- 미생물학
배경
- Micro AHR 출력물은 세밀한 내부 분석이 필요한 작은 유기체들입니다.
- 전통적인 이미징 방법은 실제 구조를 가리는 아티팩트를 유발할 수 있습니다.
- 싱크로트론 X선 단층촬영은 고해상도의 해결책을 제공합니다.
- 본 연구는 모델 유기체로서 진드기 Aus Long osis에 집중합니다.
연구 목적
- 마이크로 AHR 출력물의 내부 구조를 시각화하기 위함입니다.
- 방사광 X선 단층촬영의 효과를 입증하기 위함입니다.
- 이러한 소형 생물체의 조직 구성에 대한 통찰력을 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 유럽 싱크로트론 방사광 시설(ESRF)에서 싱크로트론 X선 단층 촬영을 수행하였습니다.
- 시료를 임계점 건조한 후 이미징을 위해 고정하였습니다.
- 이미징은 20.5 KEV에서 진행되었으며, 1,500장의 투영 영상을 촬영하였습니다.
- 데이터 재구성을 위해 볼륨 렌더링 소프트웨어를 사용하였습니다.
주요 결과
- 3D 단층 촬영 데이터셋은 0.7µm의 픽셀 해상도로 제작되었습니다.
- 내부 구조는 자연 상태 그대로 재구성되었습니다.
- 이 방법은 조직학적 절편 제작으로 인한 아티팩트를 성공적으로 방지하였습니다.
- 시각화를 통해 micro AHR 출력부의 조직 구성에 대한 새로운 통찰을 얻을 수 있었습니다.
결론
- 싱크로트론 X-선 단층 촬영은 비침습적 이미징을 위한 강력한 도구입니다.
- 이 기술은 작은 생물학적 구조에 대한 이해를 높여줍니다.
- 향후 연구에서는 이 방법을 생물학의 다양한 응용 분야에 활용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업계 관련성 요약
서브마이크론 해상도의 비침습적 3D 시각화 기술을 통해 파괴적인 절편 제작 없이 마이크로 규모 생물학적 시스템의 내부 구조를 상세하게 분석할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 천연 상태의 정량적 형태학적 데이터를 제공함으로써 초기 발견 단계에서 타겟 검증 및 기전적 리스크 감소를 지원합니다. 이 방법은 샘플 크기나 전처리 과정의 아티팩트로 인해 전통적인 조직학적 분석이 어려운 질환 관련 모델에서 표현형 스크리닝 및 분석법 개발에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 미세 절지동물 모델의 내부 기관 시스템에 대한 3D 재구성을 통해 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 희귀하거나 제한된 샘플에 대해 비파괴적 이미징을 제공하여, 후속 분석을 위한 시료를 보존합니다.
- 예측적 가치: 절편 제작으로 인한 아티팩트 없이 기능적 해부학 및 조직 구조를 시각화함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 정밀한 표현형 분석 및 구조적 비교를 위해 0.7µm 픽셀 해상도의 정량적 형태학 데이터셋을 생성합니다.
- 운용적 가치: 키프레임 카메라 궤적과 가상 절단면을 사용하여 표준화되고 재현 가능한 볼륨 렌더링 워크플로우를 가능하게 합니다.
- 분석 준비도: 전체 장기 시스템(예: 소화관)의 시각화를 용이하게 하여 바이오마커 선택 및 기능적 판독 설계에 필요한 정보를 제공합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 애니메이션 3D 시각화를 통해 질병 관련 시스템 내 내부 구조의 종단적 추적을 가능하게 합니다.
- 기전적 리스크 감소: 숨겨진 해부학적 특징(예: 세포 내 구조, 판막 기전)을 밝혀 병태생리학적 경로를 명확히 합니다.
- 전임상 일치성: 모델 시스템 전반에 걸쳐 아티팩트 없는 구조적 검증을 제공함으로써 리스크가 조정된 진행 결정을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 샘플 준비 후 기능 분석 개발 전의 비파괴적 이미징 단계로서 초기 발굴 워크플로우에 통합되어, 타겟 검증 연구의 반복적 설계를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 마이크로 규모 생물학적 시스템의 내부 조직을 밝힘으로써 가설 검증과 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 세포 내 해상도가 필요한 고함량 스크리닝 플랫폼에 적합한 정량적 3D 결과물을 제공합니다.
- 분석: 실험 조건 간의 통계적 비교를 위한 형태 측정 랜드마크 및 부피 측정값의 추출을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 기능적 표현형과 상관관계가 있는 천연 상태의 구조 데이터를 제공하여 전임상 검증과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 미생물 모델 시스템의 프로젝트 간 적용을 위한 재사용 가능한 이미징 역량을 구축합니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 조직학적 아티팩트를 제거하고 고유한 미세 구조를 보존함으로써 타겟 검증의 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 싱크로트론 프로토콜과 소프트웨어 기반 시각화 파이프라인을 통해 재현성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 리드 후보 모델에서 구조적 이상을 조기에 발견함으로써 후기 단계의 실패 위험을 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 질환 관련 마이크로 모델의 신뢰할 수 있는 정량적 구조 데이터를 통해 go/no-go 결정에 근거를 제공합니다.
실행 시 고려 사항
- 방사광 안전, 단층 재구성 및 볼륨 렌더링 소프트웨어(예: Fiji, VG Studio Max)에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 20.5 keV에서 서브마이크론 해상도 이미징이 가능한 빔라인 기능을 갖춘 방사광 시설(예: ESRF)의 이용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 시료 준비(임계점 건조, 마운팅) 및 이미징 파라미터(1,500개 투영, 회전 프로토콜)의 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 미소 절지동물 종에 따른 시료 밀도, 큐티클 경도 및 마운팅 매체의 차이에 따른 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 시료 크기 제한(<1 mm) 및 장시간 빔 노출 시 방사선 안정성이 확보된 표본의 필요성에 의해 제한됩니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:18
Introduction
0:38
X-ray radiation tomographic measurements
2:08
Removing the background and extracting the sample information
2:38
Rotating the object using the keyframer
3:25
Setting the virtual plane
4:06
Moving the slice through the object using the keyframer
4:45
User specific camera paths
5:23
Following the digestive system through the whole animal
