개발하고 성인 단계에서 중개 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일 Caenorhabditis 엘레간스

다음 실험의 전반적인 목표는 개별 대사 경로, 유전적 변이 및 약물 처리에 의해 유발되는 당분해, 피루브산 대사 및 트리카르복실산 회로 내의 전신 수준에서의 실시간 대사 변화를 비침습적으로 모니터링하는 것입니다. 이는 살아있는 선충에게 안정 동위원소를 공급하여 더 많은 대사물질에 충분한 동위원소 농축을 유도함으로써, 중간 대사 경로에서의 유전적 및 약물적 변화를 정량화할 수 있도록 하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 기체 비율 질량 분석법을 통해 대기 및 용존 이산화탄소의 동위원소 통합을 측정하며, 이를 통해 짧은 시간 동안의 중간 대사 플럭스(metabolic flux)를 보다 직접적으로 평가할 수 있습니다.

다음으로, 선충의 대사 플럭스 변화를 정량화하기 위해 HPLC를 이용한 전신 유遊離 아미노산 분석과 GCMS를 이용한 아미노산 및 유기산의 동위원소 농축 분석을 수행합니다. 안정 동위원소 노출 후, 야생형 선충에서 동위원소 노출 시간의 변화, 박테리아 제거, 그리고 다양한 선충 파쇄 방식이 중간 대사산물의 동위원소 풍부도에 미치는 영향을 확인하는 결과를 얻습니다. 이 방법은 중간 대사 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

이 방법은 포유류 세포주 및 조직과 같은 우리의 시스템에도 적용될 수 있습니다. 우리는 일차 호흡 변화 기능의 중간 대사 흐름 손상을 시사하는 HPLC 기반의 유리 벌레 아미노산 분석에서 일관된 이상을 관찰했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 이 절차를 시작하려면 다음과 같이 진행하십시오.

발달 단계 또는 성체기에 안정 동위원소 표지 대사 전구체에 노출된 벌레들을 1.5 milliliter 플라스틱 원심 분리 튜브에 수집합니다. 일반적으로 벌레의 농도가 1 milliliter당 1000마리가 되도록 희석합니다. 벌레들에 내부 표준 물질인 epsilon aminocaproic acid가 포함된 60% per chloric acid를 첨가하여 최종 농도가 4% per chloric acid 및 20 nanomolar의 내부 표준 물질이 되도록 합니다.

중력에 의해 벌레가 가라앉을 때까지 5분 동안 방치한 후, 상층액을 제거하여 다른 튜브에 보관하십시오. 다음 단계는 본 절차에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 유리 대사체 분석 전에 스크리닝을 통해 벌레를 완전히 파쇄해야 합니다. 플라스틱 균질기와 전동 드릴을 사용하여 벌레 샘플을 15초 동안 갈아주십시오.

광학 현미경으로 벌레의 파쇄 상태를 시각적으로 확인하고, 필요한 경우 분쇄 과정을 반복하십시오. 이 이미지에서 패널 A와 B는 분쇄 전의 벌레를 보여줍니다. 분쇄 후의 벌레를 보여주는 패널 C와 D와 대조적으로, 이전에 저장해 둔 상층액을 벌레 균질액 원심분리용 1.5 milliliter 플라스틱 원심분리 튜브로 옮기십시오.

샘플을 2,250 RPM, 1,300 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 새로운 7 mL 유리 튜브로 옮깁니다. 펠릿은 추후 단백질 농도 분석 시 사용하기 위해 보관합니다.

이제 샘플의 pH 범위가 7~8이 될 때까지 상층액에 일반 수산화칼륨을 4회 첨가합니다. 염을 제거하기 위해 7 mL 유리 튜브에 담긴 중화된 샘플을 2,250 RPM(1,300 Gs)에서 5분 동안 원심분리합니다. 각 샘플의 상층액을 새로운 7 mL 유리 튜브로 옮깁니다. 이제 중화된 샘플을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 가스 크로마토그래피 질량 분석법(GCMS)을 이용한 대사체 정량 분석에 사용할 수 있도록 준비할 수 있습니다.

중화된 각 시료에서 50 µL를 분리하여 HPLC에 직접 주입합니다. 유리 아미노산 정량은 알데히드를 이용한 사전 칼리브레이션 유도체화와 형광 검출법을 통해 수행합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 나머지 중화된 시료는 다음 섹션에서 보여주는 아미노산 및 유기산의 동위원소 농축도를 결정하기 위해 이온 교환 수지를 이용한 GCMS 추출 과정을 거치게 됩니다.

비즈를 준비하려면, 일반 염산(hydrochloric acid)을 G1 및 G50 비즈에 각각 첨가하십시오. 1L 비커에서 마그네틱 스터러를 사용하여 각 플라스크를 30분 동안 교반합니다. 그 후, 세척액의 pH가 물의 pH와 같아질 때까지 비즈를 탈이온수로 10회 세척하십시오.

다음으로, 유리 피펫을 사용하여 저비용의 맞춤형 컬럼을 제작하는 방법을 설명하겠습니다. 기성 컬럼은 시중에서도 구입할 수 있습니다. 컬럼을 준비하려면 포셉을 사용하여 파스퇴르 피펫 팁의 가장 좁은 부분 바로 위에 면 마개를 삽입하고, 유기산 추출용 G 1 비드와 G 50 비드를 사용하십시오.

아미노산 추출을 위해 각 컬럼 높이의 약 1/3까지 채웁니다. 샘플이 이미 중성 pH인 경우, AG 1 컬럼에 적용하기 전에 샘플에 아무것도 첨가하지 않습니다. 아미노산 추출을 위해 유기산을 추출하려면, AG 50 컬럼에 적용하기 전에 샘플에 0.1 normal 염산을 1 mL 첨가합니다.

이제 이전에 준비한 중화된 시료를 각 컬럼에 적용합니다. 세척액이 중성이 될 때까지 각 컬럼을 물로 10회 세척합니다. 세척이 완료되면, 각 컬럼을 라벨이 부착된 새로운 4 mL 유리 시료 바이알에 용리합니다. 유기산 추출의 경우, AG 1 컬럼에 3 N 염산을 3 mL 첨가합니다.

이를 통해 3개 탄소종, 4개 탄소종, 5개 탄소종 및 6개 탄소종 간의 총 표지 탄소 수에 대한 동위원소 농축 분석이 가능합니다. 아미노산 추출을 위해, G 50 컬럼에 4 N 수산화암모늄 3 mL를 첨가합니다. 이를 통해 3개 탄소종과 5개 탄소종 간의 총 표지 탄소 수에 대한 동위원소 농축 분석이 가능합니다.

유기산과 아미노산 추출이 모두 완료되면, 샘플 바이알을 반응성 앱 쓰리(reactive app three) 증발기에 넣고 건조될 때까지 하룻밤 동안 둡니다. 그 후 샘플을 유도체화하고 프로토콜 본문에 상세히 설명된 대로 GCMS로 분석합니다. 이 절차는 1,000마리의 젊은 성체 웜을 유니버설 라벨링된 carbon 13 glucose와 e coli가 포함된 실험용 35 millimeter NGM 배지 플레이트로 옮기는 것부터 시작하십시오.

다음으로, 덮개를 제거한 실험용 NGM 플레이트를 준비합니다. 정밀한 대기 샘플링 및 교체를 위해 밀봉된 3방향 스톱콕(three-way stop cock)이 장착된 맞춤형 유리 챔버에 플레이트를 넣습니다. 광학 투명 유리 디스크가 플레이트 위에 놓이는 밀봉 부위를 고진공 그리스로 덮습니다.

유리 디스크로 챔버를 밀봉합니다. 시간을 기록하십시오. 기준 시간(time zero)으로부터 30분 후에, 3방향 스톱콕을 사용하여 20 mL 주사기로 유리 챔버 내의 분위기 가스 10 mL를 채취합니다.

챔버의 스톱콕을 닫습니다. 샘플링 후, 샘플을 0.1 M 수산화나트륨에 용해된 1 mL 중탄산나트륨이 들어 있는 레드 튜브 진공 유리관으로 옮깁니다. 다음으로, 3방향 스톱콕을 통해 유리 챔버에 10 mL의 공기를 주입합니다. 20 mL 주사기를 사용하여 챔버의 스톱콕을 닫습니다. 대기를 재주입한 후 배양을 재개하기 전에, 60, 90, 120분 간격으로 유리 챔버에서 대기 샘플링을 반복합니다.

프로토콜 본문에 설명된 대로 가스 비율 질량 분석기를 사용하여 이러한 대기 이산화탄소 시료의 표지 탄소 농축도를 분석하십시오. 살아있는 또는 UV 조사로 사멸시킨 OP 50 e coli를 먹인 벌레의 대기 이산화탄소 및 용해된 벌레 이산화탄소에서 측정된 표지 탄소 결과에서 알 수 있듯이, 안정 동위원소는 성체 초기 벌레에 2시간 후 잘 통합되었습니다. 탄소 13 이산화탄소 대 탄소 12 이산화탄소의 비율은 방출된 대기 이산화탄소 분획에 비해 용해된 벌레 이산화탄소 분획에서 더 높게 나타났습니다. 유충기부터 안정 동위원소에 장기간 노출시킨 후, 박테리아가 없는 NGM Aate에서 벌레를 세척했을 때 성체 초기 벌레의 유리 글루타메이트 동위원소 농축도가 증가하는 것이 관찰되었습니다.

이 그래프에서 L1은 L1 larval stage부터 959 cell young adult stage까지 탄소 13로 전표지된 glucose와 OP 50 bacteria를 섭취한 worm을 나타내며, YA는 egg laying young adult stage의 첫 번째 날에 도달했을 때부터 48시간 동안 탄소 13 glucose와 OP 50 bacteria를 섭취한 worm을 나타냅니다. x축은 각 glutamate 종의 표지된 탄소 원자의 총 수를 나타내고, y축은 enrichment 백분율을 나타냅니다. 모든 동물은 후속 샘플 준비 전에 과잉 표지된 동위원소를 제거하였습니다.

GCMS 분석에서 녹색 막대는 PCA 추출 전 2시간 동안 NGM 플레이트에서 OP 50 E coli를 급여하여 동위원소에 노출시킨 후 세척한 벌레를 나타냅니다. 파란색과 회색 막대는 동위원소 노출 시간 과정과 관계없이, PCA 추출 전 NGM 플레이트에서 박테리아 없이 각각 2시간 또는 6시간 동안 동위원소에 노출시킨 후 세척한 벌레를 나타냅니다. 동물을 플레이트에서 2시간 또는 6시간 동안 세척했을 때, 중간 대사산물의 동위원소 농축에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다.

두 가지 동위원소 노출 과정 모두에서, 무표지 박테리아를 2시간 동안 먹여 동물을 세척했을 때 중간 대사물에서 동위원소 농축도가 더 낮게 관찰되었습니다. 따라서 동위원소가 포함된 박테리아 도말 NGM 플레이트에서 배양된 벌레의 경우, 중간 대사물의 농축 백분율을 최적화하기 위한 최적의 세척 프로토콜은 도말되지 않은 NGM 플레이트에서 2시간 동안 세척하는 것으로 결정되었습니다. 이후 박테리아가 없는 6-탄소 13 glucose 액체 배지에서 24시간 동안 처리하였습니다.

이 그림에서 나타낸 바와 같이, 초음파 처리만으로 파쇄한 벌레 샘플과 초음파 처리 및 마쇄를 병행하여 파쇄한 벌레 샘플을 비교하였습니다. 초음파 처리와 마쇄를 병행하여 파쇄한 벌레는 초음파 처리만으로 파쇄한 샘플보다 더 높은 동위원소 농축도를 보였습니다. 결과적으로, L1 단계부터 플레이트에서 발달하는 동안 또는 성체 초기에 액체 배양액에서 24시간 동안 안정 동위원소 전구체를 살아있는 벌레에게 공급함으로써, 해당 발달 단계 이후의 해당 작용, 피루브산 대사 및 트리카르복실산 회로를 통한 플럭스를 나타내는 대사물질 간의 동위원소 농축도를 정밀하게 분석할 수 있게 되었습니다.

이 기술은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 중간 대사 흐름을 탐구하는 미토콘드리아 질환 연구의 토대를 마련했습니다. 이 영상을 시청한 후, 귀하는 예쁜꼬마선충에서 중간 대사의 안정 동위원소 프로파일링 및 대사 흐름을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.