기본

이 영상에서는 *C. elegans*를 L1 단계에서 동기화하는 방법을 보여드리겠습니다. 이는 간단한 방법이지만 매우 흔히 사용되므로, 입문자분들에게 상당히 유용할 것입니다.

C 언어 전문가라면 본 프로토콜을 최적화하기 위한 몇 가지 팁을 여기서 찾으실 수 있을 것입니다. 웜의 동기화 원리는 성체 웜과 배아가 알칼리성 차아염소산염 용액에 대해 가지는 상대적인 저항성 차이에 기반합니다. 많은 배아를 품고 있는 성체 웜을 차아염소산염 용액과 함께 배양하여 성체는 사멸시키고 배아만 남게 하는 방식입니다.

동기화의 두 번째 단계는 먹이의 부족을 통해 이루어지며, 이를 통해 배아가 서로 다른 시간에 부화하더라도 L1 단계 이상으로 발달하지 않게 합니다. 블리칭 프로토콜을 시작하기 위한 첫 번째 단계는 벌레가 산란 단계에 있고 플레이트에 여러 개의 알이 흩어져 있도록 하는 것입니다. 성체들을 회수하여 수확하기 위해 M9을 사용하십시오.

또한, 플레이트 표면에 이미 도달한 배아들은 엑스레이 필름 조각과 같은 부드러운 재료로 긁어낸 후, 여러 번의 M9 세척을 통해 회수된 박테리아를 씻어낼 수 있습니다. 보통 두 번 정도면 충분합니다. 벌레들을 세척하고 나면, 선호도에 따라 갓 조제한 표백 용액을 첨가할 차례입니다.

튜브를 흔들면서 배양 시간을 조절하십시오. 실체 현미경을 통해 성체의 생성을 관찰할 수 있습니다. 사체가 거의 남지 않았다고 판단되면, 튜브가 완전히 찰 때까지 M nine을 첨가하여 반응을 중단시키십시오.

프로토콜을 마무리하려면 최소 3회 세척을 수행하십시오. M9 버퍼에서 밤새도록 지속적으로 흔들어주며 알을 배양하면, 부화는 가능하지만 선충의 추가적인 발달은 억제됩니다. 동기화는 15°C에서 25°C 사이의 어떤 온도에서도 수행할 수 있지만, 15°C를 권장합니다.

발달 속도가 더 느리기 때문에, 앞서 언급한 바와 같이 C. elegans는 성체가 되기 전 4단계의 유충 단계를 거치며, 그 소요 시간은 사육 온도에 따라 달라집니다. C형 C. elegans는 15에서 25도 사이의 성장 온도에서도 생존할 수 있지만, 온도가 높을수록 성장 속도가 더 빠릅니다.

높은 온도에서의 결과를 보면, 24시간 후에 벌레들의 발달 단계가 서로 다르다는 것을 알 수 있습니다. 15°C와 25°C에서 비교했을 때, 25°C에서는 48시간 후에 이미 배아가 관찰됩니다. 반면, 플레이트 표면에서 배아를 확인하려면 80시간 이상 기다려야 합니다.

최적의 결과를 얻기 위해 15°C에서 배양한 선충을 사용할 때, 블리칭(blitzing) 실험을 수행하며 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. 또한 실험을 수행하기에 적절한 단계의 선충을 식별하는 것이 중요합니다. 따라서 크기, 미분 간섭 대조 현미경(differential interference contrast microscopy) 또는 염색법을 통해 각 단계를 구별하는 방법을 보여드리겠습니다.

이 그래프를 통해 온도에 따른 GaN 웜의 성장률을 확인할 수 있으며, 25도에서 훨씬 더 빠르게 성장함을 알 수 있습니다. 해양 생물의 크기와 발달 단계 사이에는 상관관계가 있습니다. 적절한 소프트웨어를 사용하면 동물을 측정하고 적절한 발달 단계로 분류할 수 있습니다.

하지만 이 그래프에 따르면, 부위는 발달 단계를 나타내는 대략적인 지표입니다. 미분 간섭 대비 현미경(differential interference contrast microscopy) 또는 DPI 염색을 통해 인식하고 활용할 수 있는 씨앗(seeds)의 일부와 해부학적 구조를 관찰함으로써 더 합의된 단계 설정이 가능합니다. 본 연구실에서는 이 프로토콜을 사용하여 단일 염색 내의 미세 알(micro eggs), 인시투(in situ) 시각화 및 업(up) 염색과 같은 다양한 실험을 위해 벌레들을 동기화해 왔습니다.

또한, 본 프로토콜은 오염을 제거하는 데 도움을 줍니다. 대비를 높이기 위해 미분 간섭 대비(Differential interference contrast) 또는 노마(Nomar) 현미경이 사용됩니다. 염색되지 않은 투명 시료의 경우, 2% Agros 바닥에 동물들을 살아있는 상태로 고정합니다. Agros는 미리 준비하여 4°C에 보관했다가 필요할 때 사용할 수 있습니다.

65°C에서 녹여 보관할 수 있습니다. agros가 녹으면 슬라이드 글라스 위에 테이프를 붙이고, 이를 세 번째 슬라이드 글라스의 양쪽에 배치합니다. 녹은 agros를 조심스럽게 취해 테이프가 없는 슬라이드 글라스 위에 한 방울 떨어뜨립니다.

다른 슬라이드를 가로 방향으로 놓아 아가로스 위를 덮습니다. 경로가 굳으면, 한 슬라이드를 다른 슬라이드 위로 조심스럽게 밀어 두 슬라이드를 분리합니다. 패드는 그중 하나의 슬라이드에 붙어 있을 것입니다.

벌레가 움직이지 않도록 패드 위에 Amazon을 약간 추가합니다. 해부 현미경으로 벌레를 몇 마리 골라 lele 방울로 옮깁니다. 이때 통로가 손상되지 않도록 주의하십시오.

커버 슬라이드를 준비하고 가장자리에 매니큐어를 바릅니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 이 슬라이드 위에 커버 글라스를 덮습니다. 이렇게 준비된 표본은 즉시 현미경으로 관찰할 수 있습니다. C. elegans 해부학적 구조에서 가장 쉽게 확인할 수 있는 특징 중 하나는 Alva입니다.

예를 들어, 크리스마스 트리 모양의 aava는 L4 단계의 특징입니다. 발달 과정에 따른 c elgan 해부학에 관한 자세한 정보는 www.orla.org에서 확인할 수 있습니다. Tapis 염색은 개별 세포를 식별하기 위한 일반적인 절차입니다.

터널 고정법은 선충을 고정하는 빠른 방법입니다. DAPI 염색을 위해, 먼저 현미경 슬라이드 표면에 M9 버퍼 한 방울을 떨어뜨립니다. 플레이트에서 선충을 직접 채취하여 M9 버퍼 방울로 옮깁니다.

파이펫이나 부드러운 티슈를 사용하여 과량의 M9을 제거하십시오. 벌레들에게 터널을 추가하십시오. 이 과정을 반복하십시오.

첫 번째 방울이 마르면, 표본을 현미경으로 옮기기 전에 API와 oversleep이 포함된 봉입제를 첨가합니다. warm stent와 api를 사용하여 go의 발달 과정을 쉽게 관찰할 수 있습니다.