멤브레인 후보, 시냅틱 응답,의 연결 회로, Neuromodulation과 크레이를 사용하여 근육 조직학 : 학생 실험실 연습

다음 실험들의 전반적인 목표는 흥분성 막의 특성과 휴지 막전위의 이온적 기초를 이해하고, 막전위를 측정하는 방법 및 시냅스 전달의 특성을 입증하는 법을 배우는 것입니다. 실험의 한 부분에서는 세포 외 칼륨 농도를 변화시키면서 휴지 막전위를 측정할 것입니다. 실험의 또 다른 부분에서는 다양한 운동 단위에서 자극된 시냅스 반응을 기록함으로써 시냅스 분화의 메커니즘을 조사할 것입니다.

다음으로 유지 관리가 용이한 신경 회로를 제시합니다. 이 준비 과정은 감각 기관에서 중추신경계(CNS), 운동 신경원을 거쳐 근육으로 이어지는 회로의 다양한 측면을 연구하고 교육하는 데 활용될 수 있습니다. 일련의 실험을 통해 가재 모델을 사용하여 막전위, 시냅스 통합 및 전달, 그리고 근섬유 유형의 구조적 차이와 관련된 문제를 얼마나 쉽게 다룰 수 있는지 보여줍니다.

전기생리학적 개념과 기술을 교육하는 데 있어 가재 표본을 사용하는 주요 장점은 해부가 쉽고, 최소한의 식염수만으로도 표본의 생존력을 유지할 수 있으며, 시냅스 반응을 얻기 쉽고, 근육의 전반적인 해부학적 배치를 쉽게 파악할 수 있다는 점입니다. 이러한 기술은 다른 표본에도 적용될 수 있으며, 시냅스 생리학 및 조절, 그리고 시연된 표본의 생화학적 및 구조적 차이에 대한 이해를 넓히는 데 도움이 될 것입니다. 수술을 시작하려면 몸길이가 약 6~10cm인 가재를 선택하여 으깬 얼음에 5분 동안 두어 마취시키고, 큰 가위를 사용하여 가재의 집게와 입에 손가락이 닿지 않도록 주의하며 머리 뒷부분을 잡고 머리를 절단하십시오.

가재의 눈 뒤쪽을 깔끔하게 절단하여 머리를 빠르게 제거하고, 부상을 방지하기 위해 가재의 다리와 집게를 제거합니다. 수컷의 스타일(style)과 암수 모두의 유영각(swimmerets)을 제거합니다. 제거한 머리와 부속지를 폐기합니다.

다음으로, 복부와 흉부를 연결하는 관절막을 따라 절개하여 복부를 흉부로부터 분리합니다. 가재의 복부 부분은 보관하고 흉부는 폐기합니다. 가위 끝을 배쪽 방향으로 약간 내리고 각도를 조절하여, 복부 양쪽의 하측 가장자리를 따라 껍질을 절개합니다. 이때 가재의 몸체 내부를 너무 깊게 자르지 않도록 주의하십시오.

포셉을 사용하여 가재 각 마디의 길이를 따라 형성된 껍질의 자연적인 선 패턴을 따라가십시오. 복부 근육이 손상되지 않도록 주의하며, 껍질의 배쪽 부분을 위로 끌어올려 뒤로 당겨 제거하십시오.

굴근을 제거합니다. 이 단계에서 심굴근 위에 흰색 조직 덩어리가 보일 수 있습니다. 핀셋을 사용하여 이 조직을 조심스럽게 제거하십시오.

이제 위장관이 심지굴근(deep flexor muscles)의 정중선을 따라 뻗어 있는 작은 관 형태로 보입니다. 핀셋으로 위쪽을 집어 복부에서 끌어내어 제거하십시오. 꼬리 끝부분에서 위장관의 하단을 절단하십시오.

분변성 폐기물이 표본 준비를 방해하지 않도록 식염수로 해부 부위를 헹굽니다. 해부용 핀을 사용하여 표본의 상단과 하단 모서리를 S-guard가 코팅된 페트리 접시에 고정합니다. 이제 복부 신근이 노출됩니다.

세포 내 기록을 수행할 때까지 표본이 잠기도록 페트리 접시에 식염수를 붓습니다. 페트리 접시를 현미경으로 옮기고, 접시 아래에 왁스를 사용하여 움직이지 않게 고정합니다. 세포 내 기록에 사용된 장치는 이 그림에 표시되어 있습니다.

적절한 연결 및 설정 방법은 동반 텍스트에 설명되어 있습니다. 지침에 따라 실험 차트 소프트웨어를 설정하십시오. 동반 텍스트와 같이 접지선을 식염수조에 넣으십시오.

3 M potassium chloride가 채워진 유리 마이크로피펫의 끝을 식염수 욕조에 넣고 전극 저항을 측정하십시오. 전극 저항은 20~60 MΩ이어야 합니다. 고강도 조명 하에서 증폭기의 조동 나사를 사용하여 실험 차트의 선을 0으로 이동시키십시오.

현미경으로 관찰하여 세로 방향의 DEM 근육을 식별합니다. 전극 프로브를 사용하여 세포 내 전극을 DEM 근육의 근섬유에 삽입합니다. 전극은 근섬유에 아주 살짝 삽입되어야 합니다.

세포를 완전히 관통하지 않도록 주의하십시오. 휴지 전위의 진폭을 측정합니다. 차트 창의 왼쪽 하단 모서리에 있는 위치에서 M 커서를 트레이스로 드래그하십시오.

마커 M을 기선(baseline)에 배치하고 커서를 기록된 신호의 가장 낮은 지점으로 이동합니다. 마커와 활성 커서 사이의 차이가 화면 우측 상단에 표시됩니다. 이 값이 휴지 막전위의 전압입니다.

기록된 전압을 증폭 배율로 나눕니다. 이 경우에는 10배 증폭이 사용되었습니다. 그다음 전압 단위를 V에서 mV로 변환합니다. 해당 근섬유의 휴지 전위를 기록한 후, 현미경으로 관찰하면서 근섬유에서 전극을 조심스럽게 제거합니다.

다른 근섬유들에 대해 세포 내 기록을 반복합니다. 이 실험의 다음 단계에서는 세포 외 칼륨 농도를 높였을 때 휴지 막전위에 미치는 영향을 관찰합니다. 칼륨 농도가 5.4, 20, 40, 60, 80, 100 millimolar인 6가지 가재 식염수를 사용합니다.

다음 세포 내 기록을 수행하기 위해 수축하지 않는 근육을 선택합니다. 배양액을 다음 단계의 더 높은 농도의 염화칼륨 용액으로 교체합니다. 이때 매번 준비물이 완전히 잠기도록 확인하십시오.

각 용액에 대한 막 전위의 변화를 기록하십시오. 세포 외 칼륨 농도를 높였을 때의 효과로 인한 막 전위가 이 스크린 캡처에 나타나 있습니다. 세포 외 칼륨 농도 대 막 전위의 세미 로그 그래프에 각 칼륨 농도에서의 휴지 막 전위를 표시하십시오. 세포 외 칼륨 농도가 5.4 millimolar일 때의 휴지 전위를 기준으로 정렬하십시오.

가설 곡선과 관찰 곡선에 대해, 관찰된 직선의 기울기를 가설 직선의 기울기와 비교하십시오. 이러한 전기생리학적 기록을 마친 후, 다음 단계는 근섬유의 해부학적 구조와 신경 지배 패턴을 조사하는 것입니다. 표본을 스탠딩 디시에 옮기고 메틸렌 블루를 추가하십시오.

5분 후, 메틸렌 블루를 제거하고 신선한 가재 식염수를 추가합니다. 한 마디 내의 근육에 분포하는 주신경을 찾습니다. 한 마디 내의 S-E-M-D-E-L 2D EL 1 및 DEM 근육으로 이어지는 신경 분포 패턴을 스케치합니다.

다음으로, 준비물을 흄 후드 아래로 옮깁니다. 식염수를 제거하고 고정액을 첨가합니다. 여기서 사용되는 고정액은 poin 용액입니다.

흄 후드의 목적은 고정액의 증기를 피하기 위함입니다. 이 용액이 피부에 닿거나 눈에 들어가지 않도록 각별히 주의하십시오. 눈에 화끈거림이 느껴지기 시작하면 즉시 세안기에서 눈을 씻어내십시오.

boin 용액을 준비물에 약 10분 동안 그대로 둔 다음, 피펫을 사용하여 용액을 식염수로 교체하십시오. DEL one 또는 DEL two 근육의 얇은 세그먼트를 절단합니다. 이를 유리 슬라이드 위에 올립니다.

슬라이드에 라벨을 붙입니다. SEM 근육에 대해 동일한 절차를 반복하십시오. 복합 현미경을 사용하여 두 조직 표본의 근절 띠 패턴을 관찰합니다.

다음 일련의 실험에서는 가재 복부 근육의 시냅스 반응을 기록하는 방법을 살펴봅니다. 다른 가재를 선택하여 머리를 제거하십시오. 수술 과정에서 보여주는 것과 같이 흉부와 부속지를 제거하고 복부 신근을 노출시킵니다.

이 비디오의 첫 번째 섹션에서는 현미경을 사용하여 신근으로 가는 운동 신경절을 포함하는 신경을 찾습니다. 신경에 가장 쉽게 접근할 수 있는 분절을 찾으십시오. 신경은 흰색이며, 피펫을 사용하여 표본에 식염수를 뿌리거나 표본에 가볍게 바람을 불어 확인할 수 있습니다.

이렇게 하면 신경이 움직이게 되어 식별하기가 더 쉬워집니다. 마이크로 매니퓰레이터로 고정한 흡입 전극을 신경 바로 위에 배치하십시오. 주사기를 천천히 당겨 신경을 전극 안으로 흡입하십시오.

현미경을 통해 신경이 전극 안으로 흡입되는 것을 확인할 수 있습니다. 동반된 논문에 명시된 대로 랩 차트 소프트웨어의 설정을 조정하십시오. 3 M 염화칼륨 유리 미세전극을 채운 후, 이를 헤드 스테이지와 파워랩에 연결하십시오.

증폭기의 조동(course) 노브를 사용하여 실험 차트의 선을 0으로 이동시킵니다. 전극을 삽입하기 전에 토글 노브를 여러 번 켰다 끕니다. 전극 저항을 테스트하려면 결과 값의 진폭을 측정하십시오.

현미경으로 관찰하면서 전극 프로브를 사용하여 전극을 DEM 또는 DL1 또는 DL2 중 하나의 종근섬유에 삽입하십시오. 근섬유를 관통하지 않도록 주의하십시오. 이제 실험을 위한 준비가 완료되었습니다.

흡입 전극은 분절 신경다발을 자극하는 데 사용되며, 유리 미세 전극은 근섬유로부터 시냅스 반응을 기록하는 데 사용됩니다. 위상성 반응을 유도하기 위해 그래프 자극기를 사용하여 1 Hz의 빈도로 신경을 자극합니다. 다음으로, 전극을 SEL 근섬유에 배치합니다. SEL은 강직성 근육입니다.

강직성 반응을 유도하기 위해 10 hertz의 짧은 펄스 버스트로 신경을 자극하십시오. 기록된 DEL 및 SEL 근육의 반응을 비교하십시오. 위상성 DEL 근육이 강직성 SEL 근육보다 더 큰 진폭의 시냅스 반응을 보인다는 점에 유의하십시오.

다음 실험 세트에서는 신근(extensor muscles) 대신 가재의 굴근(flexor muscles)에 집중합니다. 새로운 가재를 사용하여, 이 수술 과정에서 보여주는 것과 같이 복부를 분리하십시오. 이 영상의 첫 번째 섹션에서는 분리된 꼬리 표본을 식염수가 채워진 페트리 접시에 넣고, 꼬리와 표본의 윗부분을 핀으로 고정합니다.

긴장성 굴근(tonic flexor muscles)에 대한 dec Caro 실험에서는 복측 신경삭(ventral nerve cord)을 온전하게 유지해야 한다는 점에 유의하십시오. 메스를 사용하여 표본의 복측 면에서 두 갈비뼈 사이의 관절막을 따라 종방향으로 절개하기 시작하십시오. 이때 너무 깊게 절개하면 운동 신경근이 단절될 수 있으므로 주의해야 하며, 표층 근육이 손상되지 않도록 하십시오.

다음 단계를 수행하십시오. 현미경으로 관찰하며 가위나 메스를 사용하여 근육을 덮고 있는 얇은 막 층의 세로 절개선으로부터 가로 방향으로 절개합니다. 절개 부위를 넓혀 관절막 플랩을 만든 후, 이 플랩을 위로 들어 올립니다.

가위로 플랩을 절개하여 표층 굴근을 노출시킨 후, 표층 굴근으로부터 세포 내 기록을 수행합니다. 복부 신근의 휴지 막전위 및 시냅스 반응 기록에 사용했던 것과 동일한 기구 및 설정을 사용하십시오. 이전과 마찬가지로 3 M potassium chloride가 채워진 세포 내 전극을 사용합니다.

전극을 표층 굴근의 근섬유에 삽입하되, 근육을 관통하지 않도록 주의하십시오. EPSP의 자발적 활동을 기록하십시오. EPSP의 크기가 서로 다름을 확인하고, IPSP가 존재하는지 관찰하십시오.

작은 붓을 사용하여 기록 전극이 포함된 동일한 마디의 큐티클 가장자리를 조심스럽게 문지릅니다. 더 큰 반응이 관찰될 경우, 자극으로 인해 EPSP의 빈도나 크기에 변화가 있는지 확인하십시오. 이는 감각 신경 발화의 변화에 반응하여 추가적인 운동 뉴런이 동원되었음을 나타냅니다.

생리식염수 배스 용액을 1 µM serotonin과 같은 신경조절제가 포함된 용액 또는 이산화탄소가 포화된 생리식염수로 조심스럽게 교체하십시오. 그 다음 붓 자극을 반복하십시오. 배스 용액의 변경이 기록된 활성에 미치는 영향을 관찰하십시오.

배양액의 식염수를 다시 일반 식염수로 교체하고 근섬유 활성이 기저선으로 돌아오는지 관찰하십시오. 이 그림은 표층 굴근 섬유에서 기록된 EPSP를 보여줍니다. EPSP의 크기가 서로 다름에 유의하십시오.

이 실험의 다음 단계에서는 세포 외 전극을 사용하여 감각 신경에서 중추신경계(CNS)를 거쳐 운동 신경으로 이어지는 회로의 활동에 반응하는 운동 신경세포의 활동 전위를 모니터링합니다. 먼저 감각 신경을 자극하기 위한 흡입 전극을 제작하십시오. 플라스틱 튜브 조각를 화염 위에 대고 가열하여 당깁니다.

다음 단계는 튜브를 원하는 크기로 자르는 것입니다. 이를 위해 준비된 표본의 신경을 관찰하여 흡입 전극의 적절한 개구부 직경을 판단해야 합니다. 가재의 크기에 따라 신경 다발의 직경은 약 1mm에서 몇 mm까지 다양할 수 있습니다.

신경을 고정하기에 적절한 크기로 팁의 개구부를 만들기 위해, 늘어난 튜브 섹션을 절단하십시오. 개구부가 너무 크면 신경이 빠질 수 있으며, 너무 작으면 전극의 압력으로 인해 신경이 손상될 수 있습니다.

플라스틱 튜브를 유리 흡입 전극(suction electrode)의 끝부분에 장착하십시오. 전기생리학 및 소프트웨어 설정은 세포 내 기록 설정과 비교하여 세포 외 반응 모니터링 시 약간 다릅니다. 동반 논문에 명시된 장비를 사용하여, 표층굴곡근(superficial flexor muscle)을 지배하는 세 번째 경로를 흡입 전극으로 흡입하십시오.

이제 활동 전위 기록을 시작할 수 있습니다. 이 경로에는 5개의 흥분성 운동 뉴런과 1개의 억제성 운동 뉴런이 있습니다. 기저 활동을 기록한 후, 붓으로 큐티클을 자극하여 생성되는 활동 전위의 변화를 관찰하십시오.

이후, 이전 실험과 같이 배양액을 세로토닌과 같은 신경조절물질로 교체하고, 반응의 변화를 기록합니다. 추가 연습 문제는 동반된 텍스트에 제시되어 있습니다. 이 기록은 붓으로 큐티클을 자극하기 전과 자극하는 동안 세 번째 경로에서 기록된 활동 전위를 보여주며, 붓질 전의 활동 전위 빈도와 자극 중의 빈도를 비교하십시오.

이 녹화 영상은 일반 식염수와 세로토닌 용액에서 세 번째 경로로부터 기록된 활동 전위를 보여줍니다. 일반 식염수에서의 활동 전위 빈도를 방금 보여드린 세로토닌에서의 빈도와 비교해 보십시오. 브러싱(Brushing)을 하면 기저치보다 발화 빈도가 증가합니다.

또한 세로토닌이 생리식염수보다 발화 빈도를 증가시킨다는 점이 입증되었습니다. 이 그림은 브러싱과 세로토닌을 병행했을 때 발화 빈도가 더욱 크게 증가함을 보여줍니다. 외부 칼륨 농도가 휴지 막전위에 미치는 영향에 대해 외부적으로 도출된 효과와 이론적으로 도출된 효과를 비교하면, 이온이 막전위에 미치는 영향을 알 수 있습니다.

또한 phasic 근육과 tonic 근육 모두의 신경근 접합부에서 ntic 반응을 기록하는 방법도 보여드렸습니다. 이러한 기술들은 기초 개념과 생리학을 가르치기 위한 학생 탐구 실험에 활용될 수 있습니다. 본 실험 실습에서 습득한 기술들은 다른 실험 준비물과 관련된 질문뿐만 아니라 의학 및 보건 관련 생리학적 응용 분야의 문제를 해결하는 데 사용될 수 있습니다.