크레이 피쉬 Hindgut와 생리 실험 : 학생 실험실 연습

본 보고서의 전반적인 목표는 생리학 실험에 참여하는 고등학교 심화 과정 및 학부생들을 위한 생리학 과정의 교육 도구가 되는 것입니다. 학생들은 가재 후장(hind gut)을 노출시키고 수축을 기록하는 방법을 배웁니다. 추가 단계로 동물로부터 후장을 적출하며, 이를 통해 화합물을 직접 투여할 수 있습니다.

다음으로, 수축 강도를 변화시키는 메커니즘을 조사하기 위해 다양한 약리학적 제제를 처리하면서 후장 평활근 수축의 강도와 리듬을 모니터링합니다. 약리학적 분석 및 수용체 아형 분류를 기반으로 조절제가 신경 내층에 작용하는지 또는 근육에 직접 작용하는지를 보여주는 결과가 도출됩니다. 안녕하세요, 브록 대학교 생물과학과의 J Mercier 박사입니다.

저는 내장 근육을 조절하는 신경전달물질 연구를 위한 표본으로 가재의 후장을 사용해 왔습니다. 또한 이 표본을 교육 도구로 활용해 왔으며, 켄터키 대학교의 Robin Cooper 박사 연구실과의 협력을 통해 교육 목적으로 학생들이 수행할 수 있는 여러 실험법을 완성하고 있습니다. 이 방법은 가재 후장의 기능에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

또한 연동 리듬과 관련된 질환과 같은 질병 연구에도 적용될 수 있습니다. 더불어 근육 및 신경 지배의 조절 기전을 설명하는 데 사용할 수 있습니다. 학생들은 약물 제제, 신경전달물질 및 신경 호르몬을 사용하여 생리학적 및 약리학적 데이터를 해석하는 법을 배우며, 수용체 기능에 대한 전반적인 이해를 얻게 될 것입니다.

작용제와 길항제와 관련하여, 학생들은 용량-반응 곡선을 작성하고 통계 분석을 위해 데이터를 그래프 형태로 제시하게 됩니다. 동물을 마취시키려면, 몸길이가 6~10 cm인 가재를 얼음 위에 5~10분 동안 둡니다. 마취된 가재를 한 손으로 집게 뒤쪽에서 잡습니다. 양측의 안와에서 머리 중앙까지 빠르게 절개한 후, 가재의 머리를 제거합니다.

준비된 혈액은 건조되면 끈적거릴 수 있으므로, 작업이 끝난 후 도구들을 세척하십시오. 다음으로, 다리와 집게발을 제거합니다. 그런 다음 좌우 꼬리지느러미를 절단하고, 마지막 마디에 도달할 때까지 복부의 등 쪽을 따라 절개하여 중앙 꼬리지느러미만 남겨둡니다.

그런 다음 마지막 마디를 따라 자르고 반대편 아래쪽으로 절개합니다. 등갑을 제거합니다. 해부한 가재를 거즈가 깔린 페트리 접시에 놓습니다.

가재 식염수. 표본을 고정하기 위해 해부 핀을 사용하여 페트리 접시에 고정합니다. 후장은 보통 혈관과 결합 조직 덩어리로 둘러싸여 있습니다.

이를 핀셋으로 제거합니다. 이때 장이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이제 복부를 따라 후장을 확인할 수 있습니다.

해부된 가재 표본을 생리식염수에 약 10분 동안 두어 해부와 식염수 노출로 인한 충격에서 회복될 수 있도록 합니다. 후장의 느린 연동 수축을 관찰하십시오. 이제 수축 속도를 계산할 수 있습니다.

30초 동안 발생하는 수축 횟수를 세어 기록지에 기록하십시오. 또한 발생하는 수축의 유형과 그것이 연동성 수축인지 혹은 경련성 수축인지 기록하십시오. 연동파가 나타나는 경우 그 방향을 기록하십시오.

항문 근처와 복부 중간 지점의 수축 속도를 측정하여, 이 두 영역 사이에 속도 차이가 있는지 확인하십시오. 다양한 테스트 용액을 준비하고, 이를 배양용 식염수와 동일한 온도로 유지하십시오. 여기서 처음으로 테스트할 용액은 가재 식염수로 제조한 1 µM serotonin 용액입니다.

피펫을 사용하여 가재의 노출된 복부 강 내에서 식염수를 제거하고, 1 µM 세로토닌 용액을 후장에 직접 처리합니다. 새 용액을 첨가한 직후 30초 동안 대기한 다음, 항문 근처 영역에서 30초 동안 발생하는 수축 횟수를 측정하고, 이어서 복부 중간 지점에서 다음 30초 동안의 수축 횟수를 측정합니다. 이 수치들을 도표에 기록하고 발생하는 수축의 유형 또한 함께 기록합니다.다음.

기록 접시에서 테스트 용액을 따라내고 가재 생리식염수로 후장을 여러 번 헹굽니다. 그런 다음 5분 동안 30초 간격으로 표본을 헹굽니다. 이 시점에서 다음 테스트 용액을 추가할 수 있으며, 본 시연에서는 1 µM Topamine을 사용합니다.

이전과 동일하게 관찰 결과를 기록하고, 나머지 테스트 화합물에 대해 이 과정을 반복하십시오. 동일한 물질의 여러 농도를 사용할 때는 반드시 가장 낮은 농도부터 시작하여 높은 농도 순으로 진행하십시오. 위장관 수축력을 측정하기 위한 설정에는 LabChart 7 소프트웨어가 설치된 노트북, Bridge Pod, PowerLab 26T 및 힘 변환기(force transducer)가 포함됩니다.

위장관 근육 수축력을 측정하기 전에 위장관을 분리해야 합니다. 이를 위해 마지막 복부 마디의 근육을 절제하고, 항문 양측의 부드러운 복측 큐티클을 통해 두 개 이상의 핀을 고정한 다음, 힌트gut(후장)과 항문이 작은 큐티클 조각에 부착된 상태로 남도록 나머지 복부를 절제하십시오. 장은 흉부와 복부의 접합부 근처에서 절단해야 합니다.

이제 위장관을 바닥에 sardines(사드)가 코팅된 얕은 접시로 옮깁니다. 위장관의 등쪽 면을 따라 혈관이 하나 지나가고 있습니다. 이 혈관을 위장관에서 조심스럽게 분리하십시오.

준비물 위에 신선한 가재 식염수를 붓습니다. 힘 변환기(force transducer)를 준비물 위로 이동시킵니다. 힘 변환기 바닥에 접착된 핀을 자세히 관찰하십시오.

창자에 고정하는 끝부분에는 작은 굽은 부위가 있습니다. 핀의 작은 굽은 부위를 후장(hind gut)의 절단된 끝부분에 겁니다. 후장을 고정한 후, 후장이 팽팽해질 때까지 디쉬를 약간 이동시킵니다.

장관이 팽팽해야 하지만 너무 과하게 당겨지지는 않아야 하므로 이 단계에서 주의하십시오. 너무 세게 당기면 근육이 손상될 수 있습니다. 디쉬가 최적의 위치에 놓이면, 왁스나 점토를 사용하여 디쉬를 안정적으로 고정하십시오.

다음으로, 소프트웨어를 실행합니다. 기록을 시작하려면 LabChart 소프트웨어를 엽니다. LabChart 웰컴 센터를 닫습니다.

왼쪽 상단의 설정(setup)으로 이동합니다. 왼쪽 하단의 채널 설정(channel settings)을 클릭하십시오. 채널 설정에서 채널이 하나만 되도록 변경합니다.

화면 우측의 확인(okay) 버튼을 클릭하십시오. 채널 1의 오픈 브리지 포드(open bridge pod)로 이동합니다. 차트 우측 상단에서 범위를 가장 민감한 설정인 200 microvolts로 설정하십시오.

초당 사이클 수를 2K로 설정하십시오. 이제 기록할 준비가 되었습니다. 시작을 클릭하여 설정이 올바르게 작동하는지 확인하십시오.

피펫으로 트랜스듀서 팁을 가볍게 터치하십시오. 소프트웨어에 기록되는 힘의 변화가 나타나야 합니다. 소프트웨어에서 중지(stop)를 클릭한 다음, 시작(start)을 클릭하여 프로그램을 실행하십시오.

약 20초 동안 정지 버튼을 클릭하고 saline이라는 라벨의 주석을 추가합니다. 한 번의 굴곡 시작점부터 다음 굴곡 시작점까지의 시간을 측정하거나, 1~2분 동안의 전체 굴곡 횟수를 세어 수축률만 계산합니다. 수축이 일어나는 속도에 따라 수축률을 분당 수축 횟수 또는 초당 수축 횟수로 계산합니다.

수축력을 측정하려면 저장된 파일에서 서로 다른 조건하의 수축을 비교하기 위해 상대적 측정값을 사용하십시오. 마커 M을 기선(baseline)으로 이동한 다음, 커서를 편위의 정점으로 이동하여 화면 우측 상단에 표시된 값을 기록하십시오. 이 값은 M에서 정점까지의 차이인 델타(delta) 값입니다.

변화를 측정하기 위해서는 커서를 피크 지점에 고정시켜야 함에 유의하십시오. 그 다음, M 마커와 커서를 다음 관심 파형으로 이동시키고 측정을 반복하여 조절제의 효과를 조사하십시오. 이 준비물에서 식염수를 테스트 용액으로 천천히 교체하십시오.

이 경우, 1 µM 세로토닌을 투여하고 마지막 테스트로서 수축 속도와 강도를 계속 기록합니다. 본 표본에서 간극연접 억제제가 수축 속도나 강도를 변화시키는지 테스트하며, 간극연접 억제제에는 1 HEP 에탄올 또는 이산화탄소를 포화시킨 식염수가 포함됩니다. 이러한 화합물들은 장시간 노출 시 근섬유를 손상시킬 수 있으므로 가장 마지막에 사용합니다. 다양한 화합물의 효과를 비교하기 위해 데이터를 차트로 그래프화합니다.

이 표본의 또 다른 흥미로운 용도는 환상근에 의해 생성되는 힘을 기록하는 것입니다. 하지만 표본에 간극연접 억제제(gap junction inhibitors)를 처리했다면, 억제제가 환상근을 손상시켰을 수 있으므로, 이 경우에는 환상근 테스트를 위해 새로운 후장 표본을 사용해야 합니다. 환상근을 노출시키려면 미세 가위로 장관의 튜브를 세로 방향으로 절개하십시오.

미세 핀을 사용하여 한쪽 끝을 디시에 단단히 고정합니다. 트랜스듀서의 갈고리 핀을 스트립의 반대쪽 끝에 연결합니다. 종근에서 테스트했던 것과 동일한 화합물에 표본을 노출시키며, 테스트한 화합물과 수축 횟수 및 유형 간의 관계가 여기에 표시되어 있습니다.

생리식염수, 세로토닌 및 글루타메이트 용액에 대해 수축 횟수 대 시간 그래프를 작성할 수 있습니다. 또한, 생리식염수, 세로토닌, 글루타메이트 용액에 대해 수축 횟수 대 수축 강도(mV) 그래프를 작성할 수 있습니다. 이러한 그래프 작성은 종근과 환상근 모두에 대해 수행하여, 장의 서로 다른 부위에 있는 종근과 환상근이 다양한 조절제에 대해 서로 다른 반응을 보이는지 테스트할 수 있습니다.

위의 실험은 항문부터 복부를 따라 위쪽으로 올라가며 서로 다른 부위에서 반복할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 핀셋으로 위장관(GI tract)을 손상시키지 않도록 주의하고, 힘 변환기(force transducer)로 너무 강하게 당기지 않도록 유의하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 근육의 전기생리학적 기록과 같은 다른 방법들을 수행하여 이온 채널 기능 및 조절과 같은 다른 문제들을 다룰 수 있으며, 이는 다른 동물 모델의 다른 조직들을 위한 모델로 활용될 수 있습니다.