웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해

본 절차의 전반적인 목적은 적절한 제품을 사용하여 웨스턴 블롯을 간편하게 수행하는 방법을 시연하는 것입니다. 시료 준비 후, 단백질을 크기별로 분리하여 고체 상으로 전이시킵니다. 이후 항체를 이용해 단백질을 탐지하며, 적절한 프로토콜과 고품질의 가성비 좋은 시약을 사용함으로써 개선된 웨스턴 블로팅 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아주 샌디에이고에 위치한 EMD Chemicals의 R&D 과학자 Jesse Luhan입니다. EMD는 독일 다름슈타트의 Merck, KGAA 계열사입니다. 오늘은 웨스턴 블로팅 절차를 보여드리겠습니다.

그럼 시작하겠습니다. 웨스턴 블로팅의 첫 번째 단계는 시료 준비입니다. 2,500 ×g에서 5분간과 같이 저속 원심분리를 이용하여 세포를 펠렛화하여 시료 준비를 시작하십시오.

원심분리 후, 세포 펠렛을 제거합니다. 세포 10⁶개당 150 µL의 cyto buster 단백질 추출 시약을 사용하여 세포를 충분히 재현탁합니다. 샘플을 상온에서 5분 동안 배양합니다.

다음으로, 원심분리 후 4 °C에서 16,000 ×g로 5분 동안 샘플을 회전시킵니다. 상층액의 SNA를 새 튜브로 옮기고 분석을 진행합니다. 샘플의 단백질 농도를 측정한 후, 단백질을 변성시키기 위해 겔 로딩용 샘플을 준비합니다.

sodium dodecyl sulfate 또는 SDS와 같은 이온성 변성 세제가 포함된 샘플 버퍼를 사용하십시오. 혼합물을 95~100°C에서 5분 동안 가열하십시오. 시판되는 프리캐스트 겔을 사용하면 단백질을 분자량에 따라 빠르게 분리할 수 있습니다.

전기영동 장치를 전개 버퍼로 채웁니다. 전개 버퍼는 Omni PU 화학 제품군에서 제공하는 시약으로 제조할 수 있습니다. 웰의 첫 번째 레인에 trail mix 단백질 마커를 로딩합니다. 이 마커에는 전기영동 과정 중 모니터링이 가능하도록 세 개의 기준 밴드가 포함되어 있습니다.

겔 염색이 완료되면 10에서 225 kilo Daltons 범위의 10개 밴드가 관찰됩니다. 변성된 시료를 나머지 웰에 로딩하십시오. 220 volts에서 한 시간 동안 겔 전기영동을 수행하십시오.

단백질 분리가 완료되면, ready-to-use no DS 제품인 rapid stain 및 ultrasensitive stain을 사용하여 쿰시 블루(kumasi blue)로 젤을 염색함으로써 단백질이 균일하고 고르게 이동했는지 확인합니다. 전기 전하를 띤 단백질이 전기장 내에서 젤을 통해 이동할 수 있는 것과 마찬가지로, 전기장을 이용해 젤의 단백질을 NITROCELLULOSE 또는 PVDF와 같은 막으로 전이시켜야 하므로 염색 과정이 필요합니다. PVDF 막을 사용할 때는 막을 메탄올에 몇 분간 담근 후, 얼음처럼 차가운 전이 버퍼(transfer buffer)에서 5분 동안 평형화합니다. 젤 또한 얼음처럼 차가운 전이 버퍼에 몇 분간 담급니다. 이러한 평형화 과정은 전이 중 젤이 수축되는 것을 방지합니다.

습식 전사를 위해 스펀지와 여과지 사이에 겔과 막을 배치하여 샌드위치 구조를 만듭니다. 그런 다음 겔과 막 사이에 기포가 생기지 않았는지 확인한 후 조립체를 단단히 고정합니다. 이 샌드위치 구조를 전사 버퍼에 담그고 전기장을 가합니다.

음전하를 띠는 단백질은 양전하 전극 방향으로 이동합니다. 이후 막이 단백질을 멈추게 하고 결합시켜 더 이상 이동하지 않도록 합니다. 전사가 완료되면, 기포 없이 균일하게 전사되었는지 확인하기 위해 단백질을 시각화합니다.

이는 red alert Western blot 염색액으로 간단히 수행할 수 있습니다. 이 염색액은 바로 사용할 수 있으며, 물을 이용하여 쉽게 탈색할 수 있습니다. 이는 항체를 반응시키기 전, 물로 세척하여 탈색한 후 멤브레인을 블로킹한 상태의 겔 모습입니다.

비특이적 결합을 방지하기 위해 고품질의 블로킹 시약을 사용하여 막을 블로킹하십시오. 배경 신호의 증가를 피하려면 블로킹 용액에 넣고 실온에서 가볍게 흔들어주며 1시간 동안 배양한 다음, 배양 후 TBST 또는 PBST로 막을 3회 세척하십시오. 이러한 버퍼는 각각 TBS tween 정제와 PBS tween 정제를 사용하여 쉽고 편리하게 제조할 수 있습니다.

멤브레인의 블로킹과 세척이 완료되면 1차 항체와 함께 배양할 수 있습니다. 신호를 상당히 증폭시켜 주는 시그널 부스트(signal boost) 성분이 포함된 솔루션 1을 사용하여 1차 항체를 처리하십시오. 솔루션 1에 1차 항체를 준비하여 멤브레인을 1시간 동안 배양하십시오.

배양 후 추가적인 블로킹제를 첨가할 필요는 없습니다. TBST로 막을 세척하십시오. 다음으로, Signal Boost의 솔루션 2에 희석한 2차 항체와 함께 막을 1시간 동안 배양하십시오.

마지막으로, HRP 접합 2차 항체 검출을 위해 막을 TBST로 여러 번 다시 세척합니다. 여기서는 전통적으로 화학 발광 또는 ECL 방식을 통한 2차 항체 검출이 사용됩니다. 루미놀이나 증폭제를 섞을 필요가 없는 ECL reagent rapid step 제품이 사용되었습니다.

멤브레인에 수 차례 분사한 후 2분 동안 배양하고, X선 필름을 사용하여 현상합니다. Rapid Step은 low picogram 수준의 민감도를 제공하며, 기질 첨가 후 최대 2시간 동안 신호가 유지됩니다. Trail mix 단백질 마커를 사용하면 표준 Western blot 프로토콜과 비교하여 전기영동 중 단백질 추적이 가능합니다.

Signal Boost를 사용하면 더 넓은 동적 범위(dynamic range)와 감도를 확보할 수 있습니다. 마지막으로, 기존의 ECL 시약 대신 Rapid 단계를 사용하면 더욱 뛰어난 감도를 얻을 수 있습니다. 지금까지 종합적인 제품 라인업을 통해 효율적이고 비용 효과적으로 Western blinding을 수행하는 방법을 살펴보았습니다.

결과의 품질은 사용하시는 시약의 품질에 달려 있다는 점을 기억하시기 바랍니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.