종양 Microenvironment를 재현을위한 마이크로 유체 장치

본 절차의 전반적인 목표는 체외에서 종양 미세환경을 재현하여 화학요법 약물 테스트에 사용할 수 있는 미세유체 장치의 제작 및 작동을 시연하는 것입니다. 이것이 해당 미세유체 장치입니다. 이 장치는 체외에서의 간편한 화학요법 약물 테스트와 같은 다음과 같은 분야에서 유용하게 활용될 수 있습니다.

이 장치는 3차원 종양 조직 테스트에 대해 일관되고 정확한 결과를 제공하며, 생체 내 종양을 매우 정확하게 재현합니다. 종양은 3D 미세환경 내에 존재하므로, 이러한 환경에서 테스트를 수행할 수 있는 능력은 매우 중요합니다. 실험 절차의 첫 번째 단계는 장치를 조립하는 것이며, 여기에는 소프트 리소그래피를 이용한 미세유체 칩 제작, 입구와 출구에 구멍 뚫기, 유리 슬라이드에 접합, 그리고 유체 입출구를 위한 튜브 연결 과정이 포함됩니다.

다음으로, 현적법(hanging drop method)을 이용하여 장치에 사용할 균일한 다세포 종양 스페로이드를 생성합니다. 이후 스페로이드를 장치에 도입하고, 이어서 세포 사멸 유도제, 검출제 및 화학요법제를 투입합니다. 마지막으로 타임랩스 현미경 관찰을 수행한 후, 화학요법제의 침투 능력을 정량화하기 위해 약물 확산 계수를 수학적으로 추정합니다.

최종적으로, 타임랩스 형광 현미경을 사용하여 장치 내의 조직 성장, 조직 내부의 불균일한 미세환경 형성 및 조직으로의 약물 확산을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 항암제가 고형암 내부로 충분히 침투하지 못하는 것은 치료 실패의 중요한 원인입니다. 현재 대부분의 항암제 테스트 모델은 고형암의 3차원적 특성을 모방하지 못하고 있습니다.

우리는 지속적으로 관류되는 3차원 종양 조직으로 구성된 미세유체 장치를 개발했습니다. 이 모델은 고형암으로의 약물 전달과 전신 제거를 더욱 정확하게 나타냅니다. 다세포 종양 스페로이드는 3차원 종양 조직의 잘 확립된 모델입니다.

본 절차에서는 미세유체 장치에 사용할 스페로이드를 제작하기 위해 현적법(hanging drop method)을 사용합니다. 이 방법을 통해 짧은 시간 내에 일관된 스페로이드를 형성할 수 있습니다. 3차원 조직 내에서 항암제를 시험관 내(in vitro)로 테스트하면 세포 단층 모델에 비해 더욱 효율적인 방식으로 약물을 스크리닝하는 데 도움이 됩니다.

실리콘 엘라스토머의 PDMS와 경화제를 9:1 중량비로 혼합하십시오. 그다음 이 혼합물을 마스터 위에 부어 4 mm 두께의 층을 형성하고 탈기하십시오. 기포를 제거하기 위해 60 °C에서 5시간 동안 경화시킵니다.

경화된 PDMS를 몰드에서 떼어내어 엘라스토머 상에 유동 구조가 형성된 스탬프를 얻습니다. 그런 다음 드릴에 장착된 1.5mm 생검 펀치를 사용하여 입구와 출구를 위한 펀칭 홀을 뚫습니다. 잔해물을 모두 제거합니다.

스탬프의 패턴 면과 깨끗한 유리 슬라이드를 8분 동안 산소 플라스마 처리합니다. 산소 플라스마 식각기 내에서 처리된 표면들을 즉시 접촉시켜 두 표면 사이에 결합을 형성합니다. 슬라이드 워머를 사용하여 이 조립체를 60 °C에서 최소 5시간 동안 유지합니다.

결합력을 강화하기 위해 내경 0.032 inches의 PTFE 튜빙을 미세유체 장치의 입구와 출구에 연결합니다. 수형 루어 락(male lure lock) 커넥터를 바브형 암형 루어 락(barbed female lure lock) 커넥터에 부착한 인터페이스를 사용하며, 이러한 특정 커넥터들은 파손 없이 쉽게 통과시킬 수 있도록 사용됩니다. 마지막으로, 차단 밸브와 Y 커넥터를 사용하여 유량 어셈블리를 구성하고 장치를 현미경에 장착합니다. 장치를 장착한 후, 튜빙을 적절한 입구와 출구에 연결하여 유량 설정을 완료합니다.

이 그림에서 보듯이, 이러한 구성은 스페로이드를 장치 내에 쉽게 다양하게 패킹하거나, 장치를 통해 배지를 흘려보내 패킹하는 것을 가능하게 합니다. 패킹 입구 밸브 VPN과 패킹 출구 밸브 VP out을 엽니다. 그 후 종양 스페로이드를 입구를 통해 통과시켜 배양 챔버로 흘려보내면, 챔버 내의 포스트가 종양을 고정하여 배지가 흐를 수 있게 합니다.

패킹 밸브를 닫고 유입 밸브 VF in과 유출 밸브 VF out을 열어 균일한 PHE 형성을 시작합니다. 배양 후드 내에서 현탁 방울법(hanging drop method)을 사용하여 trypsin-ice 세포를 처리합니다. 원심분리기에서 결과물인 trypsin 세포를 꺼냅니다.

표 1을 참조하여 스톡 솔루션을 원하는 농도로 희석하십시오. 그다음, 48웰 플레이트의 커버를 제거하고 뒤집어서 놓으십시오. 멸균 후드 내에서 플레이트의 각 웰에 멸균수 1 mL를 채우십시오.

습도를 유지하기 위해, 커버의 각 원형 영역에 희석된 세포 용액 20 µL 한 방울씩을 넣습니다. 마이크로 피펫을 사용하여 커버를 조심스럽게 뒤집어 플레이트 위에 올리며, 이때 액체 방울이 웰의 가장자리에 닿지 않도록 주의합니다. 플레이트를 37 °C에서 배양합니다.

사용된 특정 세포에 따른 배양 시간은 표 1을 참조하십시오. 각 매달린 방울(hanging drop) 내에서 스테로이드가 형성될 것입니다. 먼저 유입구를 통해 70% ethanol로 장치를 세척하여 멸균합니다. 이어서 PBS와 H-E-P-E-S 완충 세포 배양 배지를 각각 순서대로 흘려주어 세척하십시오.

배지 시린지를 그대로 두고 튜빙에 연결하십시오. 다음으로, 시린지 탭 시린지에 스테로이드를 2~3회 흡입하십시오. 기포를 제거하려면 시린지를 장치의 패킹 입구에 연결하십시오.

입구 밸브 VPN을 열고 출구 밸브 VP out을 닫은 후 VF out을 닫으십시오. 패킹 시린지를 바늘이 아래를 향하도록 수직으로 세웁니다. 스테로이드가 시린지 바닥의 바늘 루어 락 커넥터로 가라앉는 것을 확인하십시오.

패킹 주사기의 플런저를 밀어 PHE가 튜브로 들어가 장치 내부로 흐르는 것을 확인하십시오. 이때는 패킹 배출 밸브만 열려 있습니다. 스테로이드가 장치의 챔버로 들어가 후면의 포스트에 의해 고정됩니다. 챔버 내부로 들어간 S 스페로이드는 챔버의 모양에 맞춰 직사각형 기하학적 구조를 갖게 됩니다.

입구 밸브 VPN과 출구 밸브 VP out을 닫고, 시린지 펌프에 유량 시린지 SF를 장착하십시오. 이 펌프는 syringe pump pro 프로그램을 사용하는 컴퓨터로 작동됩니다. 입구 밸브 VFN과 출구 밸브 VF out을 엽니다. 장치 내부로 배지를 3 µL/min의 속도로 흘려주기 시작하십시오.

스페로이드를 24시간 동안 배양한 후, 세포사멸 검출제를 투입합니다. 세포사멸 검출제 또는 치료제를 투입하기 전에, 영양분 구배와 미세환경이 형성될 수 있도록 스페로이드를 최대 24시간 동안 평형 상태로 둡니다. 그 후 밸브 VFN을 잠급니다.

시린지 펌프를 정지시킵니다. 펌프에서 시린지를 제거하고, 0.25 µL/mL의 CASP glow red active Caspase three 마커가 포함된 배지가 들어 있는 시린지로 교체합니다. 0.7 mL의 용액을 장치에 수동으로 플러싱하여 장치를 세척합니다.

그런 다음 주사기를 펌프에 장착합니다. 흐름을 다시 시작하고 밸브 VFN을 엽니다. 5~8시간에 걸쳐 cask glove red active cph phase three가 조직으로 확산되며, 세포 사멸 지역에서 더 밝게 형광을 발합니다. 이후의 모든 흐름 용액에는 이 농도의 세포 사멸 검출제가 유지됩니다.

Doxorubicin은 세포사멸 검출제를 처리한 후 5~8시간 뒤에 투여합니다. 이 처리물은 플러싱을 통해 시스템에서 제거합니다. 화학요법제를 추가하려면, 세포사멸 검출 절차에 따라 10 µM doxorubicin hydrochloride를 투여하십시오.

그 다음 처리 시린지를 0.7 milliliters의 배지가 들어 있는 시린지로 교체합니다. 정해진 시간 동안 치료제의 흐름을 유지합니다. 그런 다음 밸브 VFN을 잠그고 시린지 펌프의 전원을 끕니다.

시린지 펌프에서 처리용 시린지를 제거하고 0.7 milliliters의 배지가 들어있는 시린지로 교체합니다. 현미경으로 조직을 지속적으로 관찰하면서 24 내지 36시간 동안 신선한 배지가 흐르도록 합니다. 타임랩스 현미경 촬영을 위한 전체 획득 과정은 IP lab의 맞춤형 스크립트를 사용하여 자동화되었으며, 30분마다 10 x 배율로 PAX Foid의 투과광 및 형광 이미지를 획득합니다. 약물 확산 계수의 수학적 추정을 위한 첫 번째 단계는 Image J를 사용하여 docs 형광의 평균 선형 강도 프로필을 생성하는 것입니다. 챔버 내의 조직을 포함하는 직사각형 관심 영역(ROI)을 선택합니다.

plot profile 명령어를 사용하여 유로로부터의 거리에 따른 평균 강도의 프로파일을 생성합니다. 최대 세 개의 서로 다른 시간 지점에 대해 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 얻어진 강도 프로파일에서 평균 배경 형광 강도를 빼고, 각 프로파일을 해당 최대 강도로 정규화하여 X와 T의 함수로서 C를 구합니다. 여기서 C는 doxorubicin의 정규화된 농도이며, C 값은 0에서 1 사이에서 변합니다.

다음 단계는 종양 조직 내 doxorubicin의 유효 확산 계수를 평가하는 것입니다. 확산은 다음 방정식으로 나타낼 수 있으며, 여기서 ERFC는 상보 오차 함수입니다. X는 채널로부터 조직 내부로 들어간 거리이며, T는 doxorubicin 투입 후 경과된 시간입니다.

고려되는 각 시점마다 다음과 같은 반복 체계를 사용하십시오. D 값을 추정합니다. 각 위치에서 방정식의 우변을 계산합니다. X. 양변 사이의 제곱 오차 합을 계산하고, 잔차 평균을 최소화하도록 D를 수정합니다.

조직 내 doxorubicin의 평균 유효 확산 계수를 추정하기 위해 각 시점에서 얻은 D의 최적값입니다. 미세유체 장치는 3차원 종양 조직의 성장을 위해 1 mm × 0.3 mm × 0.15 mm 크기의 광학적 접근이 가능한 배양 챔버를 제공하였습니다. hanging drop 방법을 통해 여러 세포주로부터 일정하고 균일한 크기와 모양의 종양 PHE를 빠르게 형성할 수 있었습니다.

PHE를 장치에서 최대 3일 동안 성공적으로 배양하였습니다. 챔버 내의 성장은 미세환경의 재현 가능한 변형과 관련이 있었습니다. PHE 내에서, 세포 사멸은 유체 채널에 인접한 세포에서 더 적게 발생했으며, 조직의 더 높고 깊은 곳에서 더 많이 발생했습니다.

해당 장치는 독소루비신과 종양 조직의 확산 계수를 추정하는 데 사용되었습니다. 실험적으로 얻은 값은 이전에 인간 유방암에서 보고된 값과 일치했습니다. 이 절차를 수행할 때, PHE를 장치로 흘려보내는 과정은 세포 배양 외부에서 이루어져야 하므로 무균 상태를 유지하는 데 각별히 주의하는 것이 중요합니다.

멸균 상태를 유지하기 위해 후드 내의 스프레이 시린지와 튜브 끝부분에 에탄올을 충분히 뿌려줍니다. 이 영상을 시청하고 나면, 종양 내로의 약물 침투 제한이 갖는 역할에 대해 이해하게 될 것입니다. 본 영상에서는 3차원 종양 조직에서 약물의 전달 및 전신 제거를 모사하고 그 침투 정도를 정량화하는 기술을 시연하였습니다.

투과성이 낮은 약물을 배제함으로써 암 치료제 개발 과정을 상당히 효율화할 수 있을 것입니다.