Metagenomic 도서관에서 Cellulase 활동 Biomining에 대해 높은 처리량 화면

본 절차의 전반적인 목적은 메타게놈 라이브러리에서 셀룰레이스(cellulase)를 발현하는 클론을 식별하는 것입니다. 이를 위해 먼저 이미 제작된 메타게놈 라이브러리를 로봇을 이용하여 복제하고, 복제된 라이브러리를 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 그 다음 E. coli 클론의 성장을 측정하고, 복제된 라이브러리에 용해액(lysis), 버퍼 및 기질을 첨가합니다.

최종적으로, 플레이트 리더를 이용한 흡광도 측정법을 통해 셀룰라아제(cellulase) 활성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 미생물학 및 면역학과의 Steven Hallam 연구실 소속 Keith입니다. 오늘은 메타게놈 라이브러리의 고처리량 기능적 스크리닝 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 메타게놈 라이브러리의 바이오민 셀룰라아제(biomin cellulase) 활성을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 프로토콜을 시작하기 전에, 384웰 플레이트 형식으로 보관된 메타게놈 라이브러리를 준비하십시오.

본 연구에서는 PCC one copy control SMID 벡터와 라이브러리 호스트인 Farge T one resistant TRANSFECT max EPI 300 T one resistant e coli 세포를 사용하였습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 라이브러리가 포함된 플레이트를 -80 °C에서 꺼내 37 °C에서 약 20분 동안 해동합니다. 그동안 QIX two의 UV 광선 멸균 기능을 사용하여 15분 동안 로봇을 멸균합니다. 제조업체의 지침에 따라 Q fill three를 설정하고, 멸균 튜브 프로그램을 통해 매니폴드에 배지 병을 연결합니다.

Q fill three에 적절한 양의 배지를 채우고 45 µL 부피가 채워지도록 설정합니다. 각 웰에서 로봇의 퍼지 기능을 사용하여 튜빙과 매니폴드 내의 공기를 배지가 보일 때까지 제거합니다. 매니폴드의 각 핀에서 Q fill three를 사용하여 원하는 수의 플레이트를 LB 배지로 채웁니다.

각 플레이트를 채우는 데 약 20초가 소요됩니다. 다음으로, 라이브러리 플레이트와 새 플레이트를 Q picks의 적절한 구역에 로드하십시오. 로봇을 사용하여 세척조에 적절한 시약을 채웁니다.

후방 수조에는 2% micro 90을, 중앙 수조에는 오토클레이브 멸균 증류수를, 전방 수조에는 80% ethanol을 채웁니다. qix two의 복제 프로그램을 사용하여 적절한 헤드와 소스 및 대상 플레이트의 수량과 종류를 선택합니다. 또한 복제 단계 사이에 헤드를 세척하도록 설정합니다.

보통 각 배스당 6회 사이클이면 충분합니다. 기기의 용량은 한 번에 10개 플레이트입니다. 기기를 작동시키십시오.

복제하는 데 약 15분이 소요됩니다. 384핀 헤드로 전체 용량을 복제합니다. 플레이트 복제가 완료되면, 습도 유지 박스에서 37 °C로 24시간 동안 배양합니다.

아라비노스 첨가로 smid의 높은 복제 수를 유도해야 하므로 긴 배양 시간이 필요합니다. 그동안 서면 프로토콜에 설명된 대로 Q fill three 로봇을 세척하십시오. 배양이 끝나면 37 °C 배양기에서 플레이트를 꺼내십시오.

뚜껑은 따로 떼어 두고, 플레이트를 rapid stack과 함께 제공된 매거진 로딩 플랫폼 위에 놓으십시오. 소프트웨어는 플레이트 순서를 기억하지 않으므로, 사용자가 직접 플레이트 순서를 기록해야 합니다. 스택의 가장 아래에 있는 플레이트부터 읽게 됩니다.

먼저, 래피드 스택(rapid stack)에서 매거진 하나를 꺼냅니다. 매거진이 비어 있는지 확인한 후, 판독할 플레이트 더미 위로 밀어 넣습니다. 매거진의 손잡이를 잡으면 플레이트가 매거진 안으로 로드됩니다.

매거진을 올바른 방향으로 래피드 스택(rapid stack)에 장착하십시오. 연결된 컴퓨터에서 scan its re 프로그램을 실행하십시오. 새 세션을 선택하고 적절한 이름을 지정하십시오.

평평한 바닥의 384-웰 플레이트(flat bottom 384 Well plate)를 플레이트로 선택하십시오. 플레이트 레이아웃 영역에 입력하십시오. 마법사 버튼을 선택하고 이를 통해 플레이트에 384개의 미지 시료를 추가하십시오.

프로토콜 영역에서 웰 루프 옵션을 선택하고 384 웰을 입력합니다. 그러면 화면 왼쪽에 있는 플로우 트리(flow tree)에 웰 루프 아이콘이 나타납니다. 해당 아이콘을 선택하고 클릭하여 광도 측정(photometric measurement)을 추가하십시오.

읽기 파장을 600 nanometers로 설정하십시오. 프로토콜을 고유한 이름으로 저장하고 스캔 프로그램을 종료하십시오. 그 다음 Polara RS 프로그램을 실행하십시오.

메인 페이지의 VARI scan 항목 아래에는 rapid stack 장치에 연결된 기기 목록 표가 있습니다. 여기서 run session 옵션을 클릭하십시오. 그러면 중앙에 플로우 차트가 포함된 분석 창이 나타납니다. run session 항목을 선택한 다음, 저장된 스캔의 이름을 찾으십시오.

화면 오른쪽에 나타나는 드롭다운 메뉴에서 재실행(re run)을 선택하십시오. 프로토콜을 선택한 후 실행(run)을 클릭하십시오. 그러면 소스로 사용할 매거진과 비어 있는 매거진을 선택하라는 어세이 상자가 나타납니다.

화면의 하단 상자는 전면 매거진 zine에 해당합니다. rapid stack과 Vario scan이 모두 켜져 있는지 확인한 후 시작을 클릭하십시오. rapid stack이 플레이트를 플레이트 리더기에 자동으로 로드하여 플레이트의 연속 측정이 가능해집니다.

기기가 제대로 읽을 수 있도록 정렬되었는지 확인하기 위해 Vario scan에 첫 번째 플레이트가 로딩되는 과정을 관찰하십시오. 25개의 플레이트를 처리하는 데 약 50분이 소요됩니다. Vario scan 작업이 완료되면, 가득 찬 매거진을 제거하여 매거진 로딩 플랫폼 위에 놓으십시오.

플랫폼의 외부 직사각형 부분을 들어 올리면 매거진이 미끄러져 나오며, 플레이트들이 중앙에 쌓인 채로 남게 됩니다. 마지막으로, 용액 기반 스크리닝을 위해 플레이트에 덮개를 다시 덮습니다. 셀룰로오스 활성 분석을 위해, 먼저 미리 준비된 10배 농도의 lysis 스톡을 사용하여 분석 혼합액을 준비하십시오.

서면 프로토콜에 기술된 대로 pH 5.5의 50 millimolar 아세트산 칼륨 완충액을 혼합합니다. 그런 다음 DMSO 내에서 발색성 DIPHENYL 또는 DNP 세포 살생물제 기질을 75 milligrams per milliliter 농도로 스톡 용액을 준비하며, 이때 기질이 완전히 용해되었는지 확인합니다. DNP 세포 살생물제 스톡 용액을 분석 혼합물에 최종 농도가 0.1 milligrams per milliliter가 되도록 첨가합니다.

각 플레이트에는 약 20 milliliters의 용액이 사용되며, 데드 볼륨(dead volume)을 고려하여 50 milliliters가 추가로 필요하다는 점에 유의하십시오. 이전과 동일하게 Q fill three를 설정하여 각 플레이트에 분석 혼합액(assay mix)을 분주합니다. 각 플레이트를 채우는 데는 약 20초가 소요됩니다.

분석 혼합물을 첨가한 후, 플레이트를 37°C에서 12~16시간 동안 배양합니다. 습도 조절 상자 내에서 37°C 배양기로부터 플레이트를 꺼냅니다. 뚜껑을 따로 떼어 놓고, 이전과 동일한 방식으로 래피드 스택(rapid stack)에 제공된 매거진 로딩 플랫폼 위에 플레이트를 배치합니다.

스캔 및 재프로그래밍 프로그램을 열고, 광도 측정 값을 400 nanometers로 설정하는 것을 제외하고 이전에 수행한 방식대로 설정하십시오. 그런 다음 앞서 시연한 바와 같이 POLARA RS 프로그램에 파라미터를 입력하십시오.

Vario scan이 플레이트를 읽도록 합니다. 실행이 끝나면 플레이트를 제거하여 폐기하십시오. 흡광도 측정값을 내보내려면 scan it re 소프트웨어를 열고 선택하십시오.

기존 파일을 엽니다. 세션이 저장된 디렉토리를 선택하고 플러스 아이콘을 눌러 목록을 확장합니다. 제목 헤딩 아래에 컨테이너 1부터 컨테이너 N까지로 표시된 옵션들이 나타납니다. 플레이트 수에 따라, 페이지 상단의 메뉴 바에서 분석할 첫 번째 플레이트를 선택하고 데이터 리포트 내보내기(data report export)를 선택합니다.

플레이트 레이아웃 및 광도 측정 데이터와 같은 내보내기 옵션을 선택하십시오. 'view report'를 클릭한 다음 'file save'를 클릭하십시오. 원하는 디렉토리를 선택하십시오.

출력 형식은 Microsoft Excel 스프레드시트입니다. 여기에는 양성 클론이 포함된 단일 384-웰 플레이트의 흡광도 측정값이 표시되어 있으며, 양성 클론은 셀룰라아제 활성을 발현하지 않는 클론과 비교하여 흡광도가 현저히 증가함을 보여줍니다.

분석 시간, 웰, 플레이트 내 위치 또는 DNP 농도의 차이는 절대 흡광도 측정값에 영향을 줄 수 있습니다. 플레이트 평균 또는 열 평균 대비 흡광도 차이와 같은 상대적 흡광도 측정값은 셀룰라아제 양성 클론을 식별하는 더 강력한 방법입니다. 지금까지 메타게놈 라이브러리에서 셀룰라아제 양성 클론을 식별하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, DNP cell bio side를 DMSO에 용해하고 플레이트를 습도 챔버에서 배양하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.