히타치 F - 7000 형광 분광 및 PicoGreen 염료를 사용하여 dsDNA의 부량

이 절차의 전반적인 목표는 Microplate 리더기가 장착된 F 7, 000 형광 분광광도계를 사용하여 Pico green 염료로 이중 가닥 DNA 정량을 수행하는 능력을 입증하는 것입니다. 이를 위해 먼저 시료와 시약을 준비합니다. 절차의 두 번째 단계는 기기를 설정하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)에 샘플을 로딩하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 표준물질과 샘플의 측정을 수행하는 것입니다. 최종적으로, 미지 샘플의 이중 가닥 DNA 정량 분석에 사용할 수 있는 선형 검정 곡선 결과물을 얻을 수 있습니다.

Hitachi F 7, 000 Spectra 형광 광도계를 켜고 Xenon 램프를 1시간 동안 예열합니다. Excel에서 표준물질 및 시료 데이터가 포함된 파일을 생성하고 쉼표로 구분된 값 또는 CSV 형식으로 저장합니다. 형광 광도계를 설정하려면 먼저 분석 방법 창을 여는 method 버튼을 클릭하십시오.

측정 필드에서 드롭다운 메뉴를 통해 광도 측정(photometry)을 선택합니다. 이제 정량 탭을 클릭하십시오. 정량 유형 필드에서 파장을 선택하여 지정된 파장을 사용하여 형광 리딩을 수행함을 나타냅니다.

보정 유형으로 1차(first order)를 선택하고, 파장 수로는 1개를 선택하십시오. 농도 단위에는 nanograms per milliliter를 입력하십시오. 수동 보정(manual calibration) 및 원점 통과 곡선 강제(force curve through zero) 확인란이 선택되지 않았는지 확인하십시오. 소수점 이하 자릿수는 2로 선택하고, 하한 농도 한계에는 0을, 상한 농도 한계 필드에는 10,000을 입력하십시오.

다음으로, instrument 탭을 클릭하고 data mode 필드에서 fluorescence를 선택하십시오. chopping speed 필드는 인광(phosphorescence) 측정 시에만 사용되므로 비활성화되어 있는지 확인하십시오. wavelength mode 필드에서 WL fixed를 선택하고, ex WL 필드에는 480 nanometers를, EM WL 필드에는 해당 값을 입력하십시오.

520 nanometers를 입력하십시오. EX 및 EM 아래의 다른 모든 필드는 비활성 상태로 둡니다. ex slit과 EM slit을 모두 5.0 nanometers로 설정하십시오.

드롭다운 메뉴를 사용하여 PMT 전압 1~1000V 필드 앞의 확인란은 선택 해제된 상태로 둡니다. PMT 전압의 경우, 드롭다운 메뉴에서 700V를 선택하십시오. 또한 자동 통계 계산 횟수(auto statistic calc number)는 2, 반복 횟수(replicates)는 1, 적분 시간(integration time)은 0.1 seconds, 지연 시간(delay)은 0으로 선택하십시오.

이제 모니터 탭을 열고 Y축 최대값을 10,000으로, Y축 최소값을 0으로 설정하십시오. 그런 다음 데이터 획득 후 데이터 처리 항목 왼쪽에 있는 상자를 선택하고, 필요한 경우 데이터 읽기가 완료된 후 보고서가 자동으로 출력되도록 데이터 획득 후 보고서 출력 항목 왼쪽의 상자를 선택하십시오. 마지막으로, 분석 방법 창의 여러 탭에서 선택한 모든 파라미터를 저장하려면 일반 탭을 클릭하고 지정된 위치에 새로운 파일 이름으로 저장하십시오.

확인 버튼을 클릭하여 이 창을 닫으십시오. 이것으로 기기 테스트 파라미터 설정이 완료되었습니다. 마이크로플레이트 리더를 설정하려면 MPR 버튼을 클릭하여 MPR 설정 창을 앞으로 가져오십시오.

먼저 표준 시료를 위한 웰을 선택합니다. 예를 들어, A1 위치를 클릭하고 마우스를 E1까지 드래그합니다. 그런 다음 표준 세트(standard set) 버튼을 클릭합니다.

초록색으로 강조 표시된 것과 같이 표준물질에 사용할 위치를 선택합니다. 그다음 시료에 사용할 위치를 선택합니다. 마찬가지로 플레이트에서 해당 위치 위로 마우스를 클릭하고 드래그한 다음, 샘플 세트 버튼을 클릭하면 선택한 위치가 자동으로 노란색으로 강조 표시됩니다.

원하는 샘플 측정 위치에 대해 동일한 작업을 반복하십시오. 이전에 준비한 쉼표로 구분된 변수 파일에 표준물질 및 샘플 정보를 로드하려면, MPR 설정 창의 웰 정보(well information) 탭을 클릭하십시오.

로드 웰 정보(load well information) 버튼을 선택하면 웰 정보 .csv 파일을 식별하기 위한 Windows 탐색기 창이 열립니다. 정보를 로드하면 해당 창에 표 형태로 표시됩니다. Pico green 시약의 작업 용액을 준비하려면 200 X pico green 시약 50 µL를 TE 버퍼 9.95 mL에 첨가하십시오.

표준 곡선을 작성하기 위해, TE 버퍼를 사용하여 Lambda 이중 가닥 DNA를 1~100 ng/mL 범위의 최종 농도로 단계별 희석하여 준비합니다. 각 표준 용액 150 µL를 96웰 플레이트의 지정된 웰에 분주합니다. 다음으로, 각 테스트 샘플 150 µL를 플레이트의 해당 지정 웰에 분주합니다. 이제 멀티 파이펫을 사용하여 각 웰에 Pico green 용액 150 µL를 첨가하고, 용액과 DNA 샘플을 혼합합니다.

반응이 진행되도록 플레이트를 어두운 곳에서 2~5분 동안 부드럽게 배양합니다. MPR 디스플레이 화면 버튼을 클릭하여 MPR 설정 창을 디스플레이 최상단으로 띄운 다음, 교환 위치 버튼을 클릭합니다. 마이크로플레이트 홀딩 플랫폼이 기기 전면으로 이동하면, 마이크로플레이트 리더기의 도어를 열고 A1 웰이 전면을 향하도록 96 웰 플레이트를 홀딩 플랫폼에 놓은 후 마이크로플레이트 리더기의 도어를 닫습니다.

초기 위치 버튼을 클릭하여 마이크로플레이트의 A 위치를 측정 위치에 배치하십시오. 모니터 디스플레이 버튼을 클릭하여 측정 창을 디스플레이 상단에 띄우십시오. 측정 버튼을 클릭하여 표준 물질과 미지 시료의 측정을 시작하십시오.

적절한 검정 곡선은 F 7,000 소프트웨어에서 제공하는 다양한 파라미터를 사용하여 평가합니다. 예를 들어, Pico green 염색액을 이용한 이중 가닥 DNA 정량 분석에서 얻은 이 이상적인 검정 곡선의 계산된 결정 계수는 0.99993입니다. 설명된 고처리량 시스템은 Pico Green 염색액, 마이크로플레이트 리더가 장착된 Hitachi F 7,000 형광 분광 광도계, 그리고 데이터 수집, 저장, 분석 및 제시를 자동화하는 소프트웨어 프로그램 등 여러 기술의 직렬 조합으로 구성됩니다.

강력한 기술들의 조합을 통해 소량의 이중 가닥 DNA를 정확하게 분석해야 하는 증가하는 수요를 해결할 수 있습니다.